[发明专利]一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法。

背景技术

重组蛋白的规模化生产一直是重要的技术问题。应用传统原核生物发酵的方法虽然产量高，但产品的脱毒比较麻烦，而且应用安全性存在隐患；而应用真核细胞培养的方法使产品的安全性得到了提高，但成本较高、产量低。随着基因工程和基因测序工作的不断完善和发展，对已经获得的基因进行表达检验及生产重组蛋白的大量生产越来越多，因此建立高效的生物反应器具有很高的实用价值。

传统的真核细胞表达需要复杂的设备和很高的培养条件，其培养成本高，技术要求高，投资大，一般要达到上千万元或几千万元。生产过程要消耗大量昂贵的培养液，生产成本也很高。而肿瘤细胞培养简单而快速，增繁能力强，细胞株可接种腹腔，产生有表达产物的腹水，从而降低了成本。另一种传统的重组蛋白生产方式是应用原核生物发酵的方法，此法虽然成本低，但产物中含有细菌毒素，给后期加工提出了更高的要求和复杂的处理，由此也会降低产品的安全性。肿瘤细胞是一种低分化细胞，可无限扩增，但由于低分化的特性，一般外源基因不能在肿瘤细胞中表达。本发明将肿瘤细胞与转基因细胞融合，使其有组织细胞表达目的基因的功能，而且保留无限扩增的特性，实现了转基因杂交瘤细胞的表达，并达到可生产水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法，该方法可应用于制备生物药品、生物试剂、疫苗、营养保健品及其它蛋白质类生物材料，应用本发明方法可以缩短产品研究开发周期，降低成本和实现规模化生产。

本发明采用外源基因可在低分化的肿瘤细胞和杂交瘤细胞中表达，建立了应用肿瘤细胞高效表达重组蛋白的方法。具体的技术方案是：

一种利用肿瘤细胞生产生物活性产物的方法，包括以下步骤：

(1)构建含有5′核心序列-功能基因-3′核心序列-NEO^r基因构件的表达载体，该载体可在杂交瘤细胞中高效表达，所说的5′核心序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中SEQ ID NO.2位于SEQ ID NO.1上游，3′核心序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)分离上述(1)构建的表达载体中的基因构件，制备转基因小鼠，从转基因小鼠后代(F1代或其后裔)成体中分离得到转基因淋巴细胞、成纤维细胞或乳腺上皮细胞；

(3)将(2)得到的转基因细胞与小(大)鼠肿瘤细胞(SP2/0)融合，制备转基因杂交瘤细胞；杂交瘤细胞用催乳素诱导杂交瘤细胞表达，筛选出表达特性优良的细胞株；

(4)用筛选出的高表达转基因杂交瘤细胞接种泌乳期BALB/C小鼠或大鼠腹腔，收集小鼠腹腔液获得重组蛋白。

上述所说的步骤(4)还可以是，筛选出的高表达转基因杂交瘤细胞再转染带有NEOr基因构件，G418筛选后，接种泌乳期BALB/C小鼠腹腔，收集小(大)鼠腹腔液获得重组蛋白。

上述所说的基因构件，其特征在于，5′和3′核心序列侧翼增加山羊BLG调控序列。

根据上述公开的基因构件的结构，本领域的技术人员可选用已知的载体和克隆技术获得相应的基因构件。

本发明应用杂交瘤细胞可无限扩增及接种鼠腹腔产生含相应分泌产物的腹水的原理，用于大规模制备有应用价值的重组蛋白。

本发明的一个具体的方案是用上述方法制备人乳铁蛋白，其具体的步骤是：

(1)构建含有5′核心序列-功能基因-3′核心序列-NEOr基因构件的表达载体pBnLC2G(如图1)，所说的5′核心序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其中SEQID NO.2位于SEQ ID NO.1上游，3′核心序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)分离上述(1)构建的表达载体中的基因构件，制备转基因小鼠，从转基因小鼠后代(F1代或其后裔)成体中分离得到转基因淋巴细胞、成纤维细胞或乳腺上皮细胞；

(3)将(2)得到的转基因细胞与小(大)鼠肿瘤细胞(SP2/0)融合，制备转基因杂交瘤细胞；杂交瘤细胞用催乳素诱导杂交瘤细胞表达，筛选出表达特性优良的细胞株；

(4)用筛选出的高表达转基因杂交瘤细胞接种BALB/C小鼠或相应品种的大鼠腹腔，收集小鼠腹腔液获得重组蛋白。

整个技术中基因表达载体的构建；应用转基因小鼠的转基因体细胞制备转基因杂交瘤细胞是关键。