[发明专利]一种抗体标记信号放大方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗体标记信号放大方法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用，但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：(1)来源方便，易于纯化；(2)比活性高，性质稳定；(3)酶活性和量能用简单方法测定。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。目前应用HRP标记抗体技术的检测方法检测下限可达10^-16mol/L，但仍无法满足检测要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种实现可使检测下限达到10^-18mol/L以下的辣根过氧化物酶标记抗体信号放大方法。

本发明的技术方案是：

(1)、称取低熔点琼脂糖0.1g，溶于10ml纯化水，45～50℃水浴溶解后，加入新配0.1MNaIO₄ 5～10ml，50～60℃水浴反应45～120分钟后，加入9～15ml无水乙醇，沉淀析出后，8000～12000rpm离心5～20分钟，去除上清溶液后加入10ml纯化水清洗沉淀，重复操作2次，清洗结束后，加入50ml纯化水45～50℃水浴溶解沉淀，制成溶液A；

(2)、量取待标记抗体5mg，用NaOH调pH至8.6～9.6，加入100～500ul溶液A，搅拌均匀后，37℃反应30～60分钟，制成溶液B；

(3)、称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中，完全溶解后，加入100～200ul新配的0.1M NaIO₄溶液，30～37℃避光反应10～30分钟后，加入现配的10％乙二醇10～20ul，30～37℃避光反应8～15分钟后，制成溶液C；

(4)、将溶液B与溶液C按体积比1∶1～1∶3混合，30～37℃避光反应25～45分钟后，加入等体积的醛基封闭液30～37℃反应15-30分钟，然后将混合后溶液装入透析袋中，用1mM PH8.0的磷酸缓冲液避光透析12～24小时，透析结束后将混合后溶液从透析袋中取出。

有益效果：本发明的抗体标记信号放大方法，先通过用NaIO₄将琼脂糖的羟基氧化成醛基，利用琼脂糖氧化后含多位点醛基的特点，在碱性条件下将待标记抗体交联起来，然后再将交联抗体进行HRP标记，起到了信号放大作用，在同样抗原浓度条件下，获得5-10倍的信号放大。本发明提供的信号放大方法，可通过用低熔点琼脂糖经氧化后交联标记抗体达到信号放大效果，可将检测下限提高到10^-18mol/L以下。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1

(1)、称取低熔点琼脂糖0.1g，溶于10ml纯化水，45℃水浴溶解后，加入新配0.1M NaIO₄ 5ml，50℃水浴反应45分钟后，加入9ml无水乙醇，沉淀析出后，8000rpm离心5分钟，去除上清溶液后加入10ml纯化水清洗沉淀，重复操作2次，清洗结束后，加入50ml纯化水45℃水浴溶解沉淀，制成溶液A；

(2)、量取待标记抗体5mg，用NaOH调pH至8.6，加入100ul溶液A，搅拌均匀后，37℃反应30分钟，制成溶液B；

(3)、称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馏水中，完全溶解后，加入100ul现配的0.1M NaIO₄溶液，30℃避光反应10分钟后，加入新配10％乙二醇10ul，30℃避光反应8分钟后，制成溶液C；

(4)、将溶液B与溶液C按体积比1∶1混合，30℃避光反应25分钟后，加入等体积的醛基封闭液30℃反应15分钟，然后将混合后溶液装入透析袋中，用1mM PH8.0的磷酸缓冲液避光透析12小时，透析结束后将混合后溶液从透析袋中取出。

实施例2