[发明专利]表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及芽孢表面展示技术领域，特别是一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)芽孢表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢制备方法。 

背景技术

脂肪酶(EC3.1.1.3)能催化酯类水解、合成或转酯反应，生成长链脂肪酸单酯，在医药、食品、制革、洗涤剂、能源等工业生产中具有极其广泛的应用价值。尤其是利用脂肪酶生产生物柴油，因其对原料的选择性低、反应条件温和、能耗低、产物及副产物较易分离且无污染排放，是一种更理想的节能、环保型工艺(Watanabe Y，et al.J.Mol.Catal.B：Enzymatic，2007，44(324)：99～105)。但限制生物酶法制备生物柴油规模化生产的主要问题是脂肪酶生产成本高、稳定性差、利用率低、甲醇等低碳醇对酶的失活效应等缺陷，难以达到大规模生产生物柴油的要求(邓利等，生物工程学报，2003，19(1)：97～101)。生产满足市场需求的脂肪酶产品最迫切解决的问题是研制低成本、高催化活性和良好稳定性的脂肪酶。为了提高酶催化效率，降低生产成本，提高酶的使用率，通过改良生产工艺已能显著提高酶的稳定性和催化活性，但不能从根本上降低脂肪酶的生产和使用成本。另外，通过固定化酶同连续化的生物反应器的结合，使脂肪酶具有良好的催化活性和稳定性，使用寿命延长，大大降低了酶制品及整个生产工艺的成本(Noureddini H，et al.Bioresour Technol，2005，96(7)：769～777)，但脂肪酶在纯化和固定化过程中，活性容易受到破坏，导致生产成本较高。全细胞生物催化剂可克服固定化酶所存在的不足，该技术将产脂肪酶的细胞固定在载体上(如生物支架颗粒，BSPs)用作全细胞生物催化剂。操作更为简便、经济，省掉纯化的繁琐工序，而且固定化过程可在批量培养微生物时同步完成。但脂肪酶是胞内酶，催化底物和产物的转运受到细胞膜的屏障作用而降低反应速度，并且细胞内脂肪酶的表达量受底物组成和浓度的调节，需要通过向培养基中添加相应的脂肪酸以提高胞内脂肪酶的含量、酶催化活性、稳定性及膜的通透性来加以调控；并且全细胞催化剂在无溶剂体系中稳定性差，而甲醇对细胞活性、脂肪酶表达和活性均有抑制作用(^[Li W，et al.J.Mol.Catal B：Enzymatic，2007，45：122～127)。 

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为环境友好菌，其芽孢具有独特的抗逆 性、容易培养、芽孢比重大易分离、以芽孢表面展示技术制备的重组酶，不需要分离纯化；由于酶被展示在芽孢表面，可克服全细胞生物催化剂的细胞壁和细胞膜屏障；芽孢具有抗有机溶剂、高温等不利因素，能显著提高酶的催化活性和稳定性。基于上述优点，以枯草芽孢杆菌芽孢为载体，通过芽孢表面展示技术将催化活性的酶展示于芽孢表面，制备具有催化活性的重组芽孢成为工业化酶制剂研究和生产关注的焦点(Jung HC，et al.BMC Biotechnol.2006，6(23)：1-9)。本发明以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白为分子载体，将来源于细菌或动植物细胞具有三酰甘油脂水解功能的脂肪酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，构建表面展示具有脂肪酶催化活性的重组芽孢，迄今尚未见类似的报道或发明专利。 

发明内容

本发明的目的是提供一种表面展示具有催化活性的脂肪酶的重组芽孢的制备方法。该方法以枯草芽孢杆菌芽孢为载体，将具有催化三酰甘油脂水解功能的脂肪酶展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，制备表面展示具有脂肪酶催化活性的重组芽孢。 

本发明所采用的技术方案是： 

表面展示具有催化活性的脂肪酶(Lipase)的重组芽孢的制备方法，是以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白为分子载体，将衣壳蛋白基因与编码具有催化三酰甘油脂水解功能的脂肪酶基因重组后融合表达，使脂肪酶通过衣壳蛋白展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面，构建表面展示具有脂肪酶催化活性的重组芽孢。 

本发明优选枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因cotB、cotC和cotG作为表面展示蛋白的分子载体，选择微生物或动植物细胞来源的具有三酰甘油脂水解和转酯催化功能脂肪酶基因lipase为供体基因。 

本发明涉及本发明所选择的芽孢衣壳蛋白基因cotB、cotC和cotG分别与脂肪酶基因(lipase)编码序列重组后构建的质粒，在这些重组质粒中分别含有芽孢衣壳蛋白基因的启动子、不含终止密码子的编码序列与lipase的编码序列的重组基因，可在枯草芽孢杆菌分化形成芽孢时分别融合表达重组蛋白CotB-Lipase、CotC-Lipase、CotG-Lipase。