[发明专利]一种小动物全脑标本的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种标本的制备方法，特别是涉及一种小动物全脑标本的制备方法。

背景技术

制作脑部神经元染色标本，观察神经元形态，在临床诊断和科学研究中都应用广泛。它主要涉及两种技术：神经元染色和标本包埋技术。其中神经元染色技术主要包括两类：Golgi-Cox染色，普通染料(如苏木精，亚甲基蓝)染色。包埋技术按包埋剂的不同主要分为石蜡包埋、火棉胶包埋和树脂包埋等。

根据染色技术和包埋技术的不同组合，目前常用的神经元染色标本制备方法主要有以下几类：

石蜡切片标本：临床病理分析通常制作石蜡标本。其主要步骤是：标本整体石蜡包埋，再切片，然后使用普通染料对切片染色，最后装裱切片。

火棉胶全脑标本：其主要步骤是：标本先整体Golgi-Cox染色，再整体火棉胶包埋。

树脂切片标本：其主要步骤是：标本整体树脂包埋，再半薄切片，然后使用美蓝-品红等染料对切片进行染色，最后装裱切片。

以上各方法的主要性能参数如表1所示：

表1

标本                制作流程           染色方法        包埋剂       切片厚度(微米)

石蜡切片标本    整体包埋，切片后染     染料染色        石蜡           4-20

                        色

火棉胶全脑标本  整体染色，再包埋      Golgi-Cox法      火棉胶         5-200

树脂切片标本   整体包埋，切片后染色   染料染色     树脂    0.5-2

以上方法能满足很多需要，但有以下不足：无法在三个方向以相同的亚微米级分辨率观察全脑神经元三维形态。石蜡标本和火棉胶标本的切片较厚，观察神经元三维形态时，纵向分辨率(5微米)远低于横向分辨率(亚微米)。树脂切片标本虽然能获得亚微米切片，但是制作的标本不是全脑标本，且染色方法仅仅只染神经元胞体而不染神经元的树突和轴突，因此无法观察全脑神经元的完整形态。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种小动物全脑标本的制备方法，可以染较多神经元，能同时染神经元胞体、树突和轴突，对比度高，不易褪色，能够在亚微米尺度观察全脑神经元三维形态结构。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种小动物全脑标本的制备方法，其包括如下步骤：

a取小动物脑样本，将小动物深度麻醉，断头处死，取脑，脑样本可以为取自大鼠、小鼠、青蛙、兔、猫等的全脑，也可以为脑的一部分，将其固定浸染；

b将固定染色后的脑样本黑化，所用黑化液为PH值大于10的碱液；

c将上述得到的脑样本进行脱水，包括100％重量脱水剂脱水；

d将黑化后的脑样本采用包埋剂进行浸胶，包括连续两次100％重量的包埋剂浸胶；

e将经包埋剂浸胶后的脑样本放入包埋盒中，加入100％重量包埋剂浸没脑样本；

f将浸没脑样本的包埋盒加热，使包埋剂聚合，聚合温度为35～80℃，聚合时间为6小时～4天。

上述制备方法，其中，所述步骤b和c之间还包括步骤bI将黑化后的脑样本用流水冲洗，冲洗时间为0.5～24小时。

上述制备方法，其中，固定液可以为Golgi-Cox法固定液，也可采用钨酸盐改良Cox法固定液，所述固定液的组成为：

升汞         0.1％～10％重量

重铬酸钾     0.1％～10％重量

铬酸钾       0.1％～10％重量

钨酸钠或钨酸钾： 0％～10％重量

蒸馏水        余量。

上述制备方法，其中，所述步骤a中固定浸染在1～2天后换固定液一次，之后每隔20～30天换固定液一次，至少换液3次，固定浸染的温度为0～100℃。

上述制备方法，其中，所述步骤b中，所述黑化液为氢氧化锂、氨水、氢氧化钠或氢氧化钾。

上述制备方法，其中，所述步骤c中所用脱水剂为酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、蔗糖或它们的组合。

上述制备方法，其中，所述步骤c中脱水为采用不同浓度的脱水剂进行梯度脱水，之后采用100％重量脱水剂脱水，各浓度脱水剂的脱水时间为0.5～12小时，采用梯度脱水可以有效防止标本的变形，采用越密集的梯度越有利于防止变形，如果不关心变形，可以不采用梯度脱水，直接进行100％重量脱水。