[发明专利]核酸分子的生成

权利要求书

1.一种用于在反应器中生成单链多核苷酸的方法，所述方法包 括通过以下方式将双链的靶多核苷酸或其单链的衍生物进行指数扩 增：在实现固定引物延伸的反应条件下，将其上具有以连接子方式结 合的引物的固体基质与包含至少一种核酸分子的样品接触，其中所述 固定引物选自：

(i)与水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解温度 的引物；和

(ii)嵌套于两个水相引物之间的引物；

以有利于生成固定于所述固体基质上的双链多核苷酸，然后使所述固 定的多核苷酸处于变性条件以生成一条固定的单链多核苷酸及一条液 相的单链多核苷酸。

2.权利要求1的方法，还包括一个相分离步骤，以分离固定的 单链多核苷酸或水相的单链多核苷酸。

3.一种用于核酸分子的固相扩增的方法，其包括在实现固定引 物延伸的反应条件下，将其上具有以连接子方式结合的引物的固相载 体与包含至少一种核酸分子的样品接触，其中所述固定引物选自：

(i)与水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解温度 的引物；和

(ii)嵌套于两个水相引物之间的引物。

4.权利要求1或3的方法，其中所述不同熔解温度是由于以下因 素中的一种或多种：不同退火温度、引物和靶互补多核苷酸之间错配 程度以及/或者外来序列的存在。

5.权利要求4的方法，其中一个或两个所述引物包含在同源性 上与靶互补多核苷酸序列相关或不相关的尾核苷酸序列或头核苷酸序 列，从而提供高于所述另一个引物的熔解温度。

6.权利要求1、3、4或5的方法，其中所述待扩增的靶标包含凹 的5’端或平端，将所述靶标与一种5’至3’外切核酸酶一块孵育以生成单 链的多核苷酸模板。

7.一种以单链多核苷酸标记固体基质的方法，所述方法包括使用 在第一组退火条件下具有相似退火特性但在第二组退火条件下具有局部 退火特性的正向及反向引物进行双链靶多核苷酸或其单链的衍生物的指 数扩增，将扩增的扩增产物与其上固定有至少一种这样的引物的固体基 质或固体基质组合物接触，即该引物能够在第二组退火条件下与所述扩 增产物的链退火，并且将退火条件转换成所述第二组条件，从而有利于 基于基于单引物的扩增以生成固定于所述固体基质上的单链多核苷酸。

8.一种用于标记固体基质的方法，其包括在实现固定引物延伸的 反应条件下，将其上具有以连接子方式结合的引物的固相载体与包含 至少一种核酸分子的样品接触，其中所述固定引物选自：

(i)与水相引物有序列同一性但具有不同于固定引物的熔解温度 的引物；和

(ii)嵌套于两个水相引物之间的引物。

9.权利要求7或8的方法，其中所述不同退火条件或不同熔解温 度是由于以下因素中的一种或多种：不同退火温度、引物和靶互补多 核苷酸之间错配程度以及/或者外来序列的存在。

10.权利要求9的方法，其中一个或两个所述引物包含在同源性 上与靶互补多核苷酸序列相关或不相关的尾核苷酸序列或头核苷酸序 列，从而提供高于所述另一个引物的熔解温度。

11.权利要求7、8、9或10的方法，其中所述待扩增的靶标包含 凹的5’端或平端，将所述靶标与一种5’至3’外切核酸酶一块孵育以生成 单链的多核苷酸模板。

12.权利要求7、8、9或10的方法，还包括在所述反应经受所述 第二组退火条件后，转换回一组允许的退火条件，以有利于在固定的单 链多核苷酸上生成互补链以形成固定于固体基质上的双链体多核苷酸。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述多核苷酸为DNA。