[发明专利]核酸分子的生成

说明书

技术领域

本发明在广义上涉及在增强型固相多核苷酸扩增后生成单链核酸 分子的方法。本发明还提供了以单链及双链核酸分子标记固体基质的 方法。用于生成单链核酸分子及用于进行扩增反应的试剂盒也形成本 发明的一部分。本发明还提供了用于生成任选地以报告分子标记的单 链核酸分子的扩增体系，以及它们尤其作为标签、引物和探针的用 途。

背景技术

在本说明书中参考的任何现有技术不是并且不能被认为是承认或 以任何形式暗示，该现有技术在任何国家组成公知常识的一部分。

通过将链分开或者通过去除双链体的一条链，可以将双链DNA (dsDNA)转换成单链DNA(ssDNA)。通过热方式或化学方式破坏 链间键可以将双链体的链分开。去除一条链使得所需链被回收并消除 其互补链，例如Nikiforov et al.(美国专利No.5,518,900)，其描述了通 过以下方式修饰用于扩增的一个或多个引物：在待修饰引物的5’端整合 硫代磷酸核苷酸衍生物，使得它抗外切核酸酶降解。在使用聚合酶链反 应(PCR)扩增靶序列后，将dsDNA进行外切核酸酶降解。未保护的链 优选地被通过5’至3’的外切核酸酶消化，剩下包含另一条链的单链产 物。类似策略使用了抗外切核酸酶的分枝引物(branched primer) (Shchepinov et al，Nuc.Acids.Res.25：4441-4454 1997)或λ外切核酸酶 的携带5’磷酸的底物偏好性(Higuchi et al，Nucl.Acids Res.25：5685， 1989)。

非对称PCR(Gyllensten and Erlich，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：7652-76561998；美国专利5,066,584)通过应用不平衡的引物对浓度 使得一个引物处于限制浓度，在热循环过程中生成ssDNA。这有利于 由过量引物引发的ssDNA产物。该方法具有的问题是持续合成能力 (processivity)方面的固有限制，这是因为所使用的引物必须处于相 对低的浓度。

竞争性引物非对称PCR(Gillespie，1997；美国专利申请08/628,417) 采用在PCR热循环后及进一步热循环之前分开地添加竞争性引物， 以生成ssDNA。照这样，该方法需要繁琐的操作，这在特别是诊断环 境下是不利的，因为污染风险、使用者的错误以及处理时间和成本增 加。

Kaltenboeck et al，Biotechniques 12：164-171，1992描述了一种通过以 下方式产生ssDNA的方法：最初进行PCR以生成dsDNA，随后的分开 反应是使用第一次PCR的产物作为模板并且采用一个引物进行第二次 线性扩增。同样，该方法需要繁琐的操作。

固相基质已经被以PCR产物标记，使用的是其中使一个引物缀 合于固体表面上的对称PCR或非对称PCR，或者是通过其中使正向 和反向引物直接缀合于固体表面上的“桥”PCR。这些方法中的每种由 于动力学限制(有或无竞争性抑制效应的低效率底物浓度)均是相对 低效率的。根据需要，缀合于固相上的dsDNA产物可以被相对简单 地通过化学或热变性转换为结合于固相上的ssDNA产物。

美国专利6,277,604描述了在非对称PCR中使用一个固定的引物 和两个水相引物。至少一个所提供的水相引物的浓度是受限制的，以 促进固定引物引发延伸事件。然而，这会导致低效率。

明显需要开发更有效的方法，用于生成特定的单链核酸分子及用 于标记固相载体。

发明内容

在本说明书通篇及随后的权利要求书中，除非上下文中另外要 求，否则词语“包含(comprise)”及变体如“包含(comprises)”或“包 含(comprising)”应被理解为意指包括所述整数或者整数或步骤组， 但不排除任何其他整数或整数组。