[发明专利]具有改变特性的布丘氏菌属菌植酸酶变体

说明书

发明领域

本发明涉及布丘氏菌属菌(Buttiauxella spp.)植酸酶变体，编码该植酸酶的核酸和异源表达的方法。本发明涵盖的植酸酶可以用于的工业应用包括淀粉液化的方法、醇发酵和用于提高食物和动物饲料中磷酸酯的消化。 

发明背景

磷(P)是生长的必需元素。常规牲畜饲料例如谷粒、油粕饼、和来源于种子的副产品中发现的大量的磷为在称为植酸的分子中共价结合的磷酸酯形式。对于非反刍动物，这种形式的磷的生物利用度通常非常低，例如家禽和猪，因为它们缺乏从植酸分子中分离出磷的消化酶。 

注意到非反刍动物不能利用植酸的几个重要后果。例如，为了满足动物对磷的营养需要，加入无机磷(例如，磷酸二钙、脱氟磷酸盐)或动物产品(例如，肉类和骨粉、鱼粉)产生了花费。另外，植酸能结合或螯合胃肠道中的许多矿物质(例如，钙、锌、铁、镁和铜)，因此使得所述矿物质不能被吸收。此外，饲料中的大部分植酸经过胃肠道，排泄物中的磷含量提高了。这导致增加了环境中的生态学的磷负担。 

微生物的植酸酶作为饲料添加剂改善了典型的非反刍动物饲料中植酸磷的生物利用度(参见，例如，Cromwell等人，1993)。结果是向动物饲料中添加无机磷的需要减少了，排泄物中的磷水平也降低了(参见，例如，Kornegay等人，1996)。除了饲料添加剂之外，植酸酶还可以用于低植酸钙镁饲料组分的生产。例如，植酸酶可以用于谷物的湿磨法中，以生产例如低植酸钙镁玉米浆和低植酸钙镁谷物蛋白(corn gluten)；或与淀粉水解酶结合用于干磨法中，以生产葡萄糖和醇(例如，乙醇)。 

尽管植酸酶有上述用途的优点，令人惊讶的是很少有已知的植酸酶得到广泛接受的应用于饲料、淀粉液化和醇发酵工业中。其原因是酶和酶的不同。典型的担心是关于该酶在所希望的应用环境中的高生产成本和/或低稳定性/活性。如果要使植酸酶在工业应用中引起广泛关注，其必须满足许多酶标准。较重要的酶标准包括高的总比活性、低的pH最适度、对胃肠道蛋白酶的耐受和热稳定性。 

热稳定性是植酸酶作为饲料酶成功应用和淀粉液化中最重要的前提条件之一，因为在饲料和/或工艺中植酸酶暴露于升高的温度。例如，在饲料造粒工艺中温度在60到95℃之间，在淀粉液化工艺中温度在75到120℃之间。 

WO 06/043178中报道了布丘氏菌属P1-29菌中编码植酸酶的基因的DNA序列，公开于2006年4月27日。参考其中报道的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和布丘氏菌属P1-29菌的植酸酶基因的氨基酸序列(SEQ IDNO：3)。基于多个固有的特性，布丘氏菌属P1-29菌的植酸酶代表了一个很好的开端，从此为不同的商业应用开始了热稳定植酸酶的诱变方案。WO06/043178公开了布丘氏菌属P1-29菌植酸酶的许多变体(参见，例如，表1)。在WO 06/043178公开的至少一种变体被进一步改良，其中所述变体在本发明中称为BP-11。本发明涉及具有改变的特性的变体，例如改良的特性，包括但不限于与布丘氏菌属P1-29菌的植酸酶或BP-11变体相比较a)提高的热稳定性，b)增加的比活性，和/或c)增加的比活性并保留热稳定性。 

发明概述

一方面，本发明涉及这样的植酸酶，它是编码植酸酶的突变的DNA序列的表达产物，突变的DNA序列衍生自布丘氏菌属菌植酸酶前体。在一个实施方案中，植酸酶衍生自布丘氏菌属P1-29菌株。 

另一方面，本发明涉及植酸酶变体，所述变体包含对应于衍生自布丘氏菌属P1-29菌株的植酸酶中A122，D125，T167，F197，T209，A211，K240， A242，S281，Q289，A294和N303位置的替代。