[发明专利]特异性提高的转谷氨酰胺酶变体

说明书

发明领域

本发明涉及来自拉达卡轮枝链霉菌(Streptoverticillium ladakanum) 的新型转谷氨酰胺酶变体。所述变体可以用于以提高的选择性在指定的 谷氨酰胺残基处位点特异性地修饰肽。

发明背景

通过在蛋白上缀合能恰当改变肽的性质的基团而改变所述肽的性 质和特征是公知的。尤其是对于治疗用肽而言，可能期望甚至必要的是 在所述肽上缀合基团，这可以延长所述肽的半衰期。典型地，这些缀合 基团是聚乙二醇(PEG)、葡聚糖或脂肪酸-参见J.Biol.Chem.271， 21969-21977(1996)。

转谷氨酰胺酶(TGase)先前已用于改变肽的性质。在食品工业， 尤其是在乳制品工业中，许多技术可供使用例如采用TGase使肽交叉结 合(cross bind)。其它文献公开了TGase改变生理活性肽性质的应用。 EP 950665、EP 785276和Sato，Adv.Drug Delivery Rev.54，487-504 (2002)公开了在存在TGase时，含有至少一个Gln的肽和胺官能化PEG 或者类似配体的肽之间的直接反应，Wada在Biotech.Lett.23，1367-1372 (2001)中公开了利用TGase直接将β-乳球蛋白与脂肪酸缀合，以及 Valdivia在J.Biotechnol.122，326-333(2006)中报道了TGase催化过氧化 氢酶的位点特异性糖苷化。WO2005070468公开了TGase可用于将官能 团引入含有谷氨酰胺的肽从而形成官能化的肽，而该经过官能化的肽在 随后的步骤中可与诸如能够与所述官能化的肽进行反应的PEG进行反 应从而形成聚乙二醇化的肽。

转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)也已知为蛋白质-谷氨酰胺-γ-谷氨酰 转移酶，并催化以下通用反应：

其中Q-C(O)-NH₂可表示含有谷氨酰胺的肽，而Q’-NH₂则表示 胺供体，在以上讨论的反应中提供将被引入到所述肽中的官能团。

体内常见的胺供体是与肽结合的赖氨酸，而上述反应则提供了肽的 交叉结合。凝血因子因子XIII(Factor XIII)是在受伤后能实现血液凝 块的转谷氨酰胺酶。不同的TGase相互之间也存在差别，例如，在Gln 周围什么氨基酸对于蛋白质成为底物是必需的方面存在差别，即根据邻 近所述Gln残基的是什么氨基酸残基，不同的TGase将利用不同的含有 Gln的肽作为底物。如果待修饰的肽含有多个Gln残基，则该方面可以 得到利用。如果仅仅希望在所存在Gln残基中的一部分上选择性地缀合 肽，则通过选择仅仅接受相关Gln残基作为底物的TGase可实现该选择 性。

人类生长激素(hGH)含有13个谷氨酰胺残基，因此任何TGase 介导的hGH的缀合都潜在地受到低选择性的妨碍。以前已经描述，在 hGH上的13个谷氨酰胺(Gln)残基中，2个(Q141和Q40)谷氨酰胺在 TGase催化下是反应性的(WO2006/134148)。因此需要鉴定TGase，其能 够更特异性地介导hGH官能化。

发明内容

现在已经确定，来自拉达卡轮枝链霉菌(Streptoverticillium ladakanum)的mTGase(术语mTGase用于表示微生物表达的TGase， 其中从所述微生物分离所述TGase)(来自拉达卡轮枝链霉菌(S. ladakanum)的mTGase可以缩写为mTGase-SL)具有甚至更高的位点特 异性(也称作选择性)，是来自茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis) 的mTGase的2倍。

在一个实施方案中，本发明涉及分离的肽，其包含与SEQ ID No.1 中的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述序列在与 SEQ ID No.1的氨基酸残基Tyr62、Tyr75和Ser250对应的一个或多个 位置处被修饰。

在一个实施方案中，本发明涉及构建体，其编码本发明的肽。

在一个实施方案中，本发明涉及载体，其含有编码本发明的肽的核 酸。