[发明专利]包括用含3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸的共存培养基培养植物组织的共存步骤的提高植物转化效率的方法

说明书

技术领域

本申请要求2007年2月28日提交的日本国专利申请2007-49161的优 先权。

本发明涉及提高利用土壤杆菌的植物转化的效率的方法。

背景技术

作为主要谷类即玉米、稻等单子叶植物的转化方法，传统上已知有电 穿孔法、粒子枪法等。但是，这些物理基因导入方法存在如下问题：导入 了多拷贝的基因，基因的插入不是完好形式，转化植物多见畸形、不育， 等等。

利用土壤杆菌细菌的基因导入法作为双子叶植物的转化法有着普遍的 应用。土壤杆菌属细菌的宿主仅限于双子叶植物，认为其不能寄生在单子 叶植物中(非专利文献1)，但正在尝试用土壤杆菌转化单子叶植物。

Grimsley等人报告称：在土壤杆菌的T-DNA中插入玉米条纹病毒(Maize streak virus)的DNA，再将其接种至玉米生长点，确认了玉米条纹病毒的感 染。而在仅接种玉米条纹病毒的DNA时，不能确认上述感染症状，可以解 释成：以上现象表明土壤杆菌能够向玉米中导入DNA(非专利文献2)。但是， 病毒在未整合入核基因组的情况下仍具有增殖可能性，该结果并不能说明 T-DNA整合到核上。Grimsley等人进一步揭示：感染效率以接种至玉米的 茎顶部生长点时为最高(非专利文献3)，其感染需要土壤杆菌的质粒的Vir C 基因(非专利文献4)。

Gould等人用针损伤玉米的生长点后，接种带有卡那霉素抗性基因和 GUS基因的强病原性土壤杆菌EHA1，用卡那霉素选择处理后的生长点， 结果得到了显示抗性的植物。为了确认其子代的种子中具有导入的基因而 进行了Southren分析，结果对于一部分种子确认了导入基因(非专利文献 5)。这提示：在用卡那霉素对经土壤杆菌处理的生长点进行选择而得到的植 物体中，混合存在有转化细胞和非转化细胞(嵌合现象)。

Mooney等人尝试了使用土壤杆菌对小麦的胚导入卡那霉素抗性基因。 首先，通过用酶处理胚使其细胞壁损伤，然后接种土壤杆菌。处理后的愈 伤组织中增殖出极少数的认为具有卡那霉素抗性的愈伤组织，但这些愈伤 组织不能再生成植物体。此外，在通过Southren分析来确认卡那霉素抗性 基因的存在时，在所有抗性愈伤组织中均观察到导入基因的结构突变(非专 利文献6)。

Raineri等人在损伤稻的胚盘后，用强病原性的土壤杆菌A281(pTiBo542) 处理了稻的8个品种，在日本晴、藤坂5号这2个品种中观察到肿瘤状组 织的增殖。而且，将带有下述质粒的土壤杆菌接种于稻胚，观察到卡那霉 素抗性愈伤组织的增殖，所述质粒是在从T-DNA中除去激素合成基因而得 的Ti质粒中插入卡那霉素抗性基因和GUS基因而得到的。在该抗性愈伤组 织中，确认到了GUS基因的表达，但不能获得转化植物。这些可以解释为： 土壤杆菌的T-DNA被导入到稻的细胞中(非专利文献7)。

如上述，有研究报告揭示：在稻、玉米、小麦等稻科作物中也能够利 用土壤杆菌进行基因导入。然而，其都存在再现性的问题，此外，关于导 入基因的确认是不完全的、没有给出有说服力的结果(非专利文献8)。

Chan等人报告：将在2，4-D共存下培养了2天的稻未成熟胚损伤后， 在含马铃薯悬浮培养细胞的培养基中对其接种了带有npt II基因和GUS基 因的土壤杆菌。在含G418培养基上培养经过处理的未成熟胚，结果由诱导 产生的愈伤组织得到了再分化植物体。在通过Southren分析确认再分化植 物体及其子代植物体中的GUS基因的存在时，确认了无论是再分化本代还 是子代植物体中均存在导入基因(非专利文献9)。该结果支持用土壤杆菌转 化稻，但转化效率非常低，仅为1.6％，相对于供试的250个未成熟胚，显 示正常生长的再生植物体只有1个个体。为了摘出稻的未成熟胚，需要大 量劳力，因此很难说这样的低转化效率到达了实用水平。

近年来，有报告称：通过利用具有强病原性土壤杆菌的一部分病原性 基因的超级二元载体，即使在稻、玉米等单子叶植物中，也能够进行稳定、 高效率的转化(非专利文献10和11)。这些报告认为，利用土壤杆菌进行的 转化除了能够实现稳定、高效率的转化之外，还具有下述优点：所得转化 植物的突变少，导入基因的拷贝数少、且多为完好形式。继在稻、玉米中 取得成功之后，还有报告称在主要谷类即小麦(非专利文献12)、大麦(非专 利文献13)和蜀黍(非专利文献14)中利用土壤杆菌进行了转化。