[发明专利]新β-半乳糖苷-α2,6-唾液酸转移酶、编码该酶的基因和提高酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及：新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶、编码该酶的基因、以及该酶的生产方法，所述该酶的生产方法中使用了用编码该酶的基因转化的微生物。 

背景技术

糖转移酶是与生物体内的糖蛋白、糖脂等(以下称复合糖)的糖链的生物合成相关的酶。其反应生成物即复合糖的糖链在生物体内具有非常重要的功能。例如，已知糖链是一种重要的分子，其主要在哺乳动物细胞中作为处于分化、发育的细胞间及细胞-细胞外基质间的信号传导、复合糖的靶标而发挥作用。 

作为其应用例，可以列举出生产血液中的红血球的激素——促红细胞生成素。天然的促红细胞生成素存在效果持续性差的缺点。因此，促红细胞生成素本来是一种糖蛋白，通过附加新的糖链开发了可延长在生物体内的寿命的重组促红细胞生成素蛋白，并生产且实现了商品化。今后，此类附加或改变糖链的医药品、功能性食品等的开发也会越来越多。因此，寻求开发一种可任意合成/生产糖链的方法。其中，一种最有效的方法是糖转移酶的开发，其重要性越来越明显。 

至今为止，已经从人、小鼠、大鼠和酵母等真核生物中分离出约150种以上的糖转移酶基因。并已进一步在CHO细胞、大肠杆菌等宿主细胞中表达了该基因，且生产出具有糖转移酶活性的蛋白质。另一方面，从原核生物细菌中也分离出约20～30种糖转移酶基因，并已进一步在使用大肠杆菌的重组生产系统中表达具有糖转移酶活性的蛋白质，还阐明了其底物特性、各种酶化学性质。 

由于唾液酸多存在于糖链的非还原末端，对于糖链功能的表达，是极为重要的糖。于是，在糖转移酶中，唾液酸转移酶是需求最大的酶的一种。关于β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其基因，有很多动物，特别是哺乳类 动物来源的酶的报道(Hamamoto，T.，et al.，Bioorg.Med.Chem.，1，141-145(1993)；Weinstein，J.，et al.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987))。但由于这些动物来源的酶很难纯化，不能大量获得，所以其价格很高，而且存在酶稳定性差的问题。另一方面，有报导称已从属于美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)的微生物中获得了细菌来源的β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶及其基因(国际公开第WO98/38315号；美国专利6255094号公报；Yamamoto，T.，et al.，J.Biochem.，120，104-110(1996))。 

有报导称：目前已知的各种哺乳动物、细菌来源的唾液酸转移酶的反应最适pH范围均在5～6的酸性范围内(Paulson，J.C.et al.，J.Biol.Chem.，252，2363-2371(1977)、Yamamoto，T.，et al.，J.Biochem.，120，104-110(1996))。众所周知，结合在各种糖蛋白、糖脂等复合糖糖链或单纯糖链上的唾液酸在酸性条件下会缓慢分解。而且，已知CMP-唾液酸是唾液酸转移酶的糖供体底物，其价格极其昂贵，该CMP-唾液酸在酸性条件下迅速分解，但在碱性条件下极其稳定。因而，在使用唾液酸转移酶将唾液酸转移到各种复合糖、糖链上时，无论从反应后所得的含唾液酸的糖链的稳定性/保存性的观点来看，还是从有效利用唾液酸转移反应中使用的CMP-唾液酸的观点来看，均要求反应最适pH在中性至碱性的唾液酸转移酶。 

专利文献1：国际公开第WO98/38315号小册子 

专利文献2：美国专利6255094号公报 

非专利文献1：Hamamoto，T.，et al.，Bioorg.Med.Chem.，1，141-145(1993) 

非专利文献2：Weinstein，J.，et al.，J.Biol.Chem.，262，17735-17743(1987) 

非专利文献3：Yamamoto，T.，et al.，J.Biochem.，120，104-110(1996) 

非专利文献4：Paulson，J.C.et al.，J.Biol.Chem.，252，2363-2371(1977) 

发明内容

发明所要解决的问题 

本发明的课题是：提供属于弧菌科发光杆菌属的微生物来源的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶、和编码该酶的基因。更具体地，本发明的目的是：提供反应最适pH为中性至碱性的新β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶和编码 该酶的基因。