[发明专利]证明CD44表面表达的细胞的细胞毒性介导

说明书

技术领域

本发明涉及分离和产生减轻癌性疾病的抗体(CDMAB)和这些CDMAB单独地或与一或多种CDMAB/化疗试剂组合用于治疗和诊断过程中的用途。本发明进一步地涉及利用本发明的CDMAB的结合测定法。

发明背景

癌症中的CD44：针对人白血细胞的单克隆抗体的制备导致了CD44抗原的发现；一种表达在广泛的正常组织和所有类型的造血细胞上单链透明质酸(HA)结合糖蛋白。其起初与淋巴细胞的激活和归巢(homing)相关。当前，其推定的生理学作用还包括炎症基因的激活、细胞周期的调节、细胞增殖的诱导、分化和发育的诱导、细胞骨架重组和细胞迁移以及细胞存活/抵抗凋亡的诱导。

在人体中，单基因拷贝的cD44位于染色体11的短臂，11P13上。该基因包含19个外显子；前5个是恒定的，随后的9个是可变的，紧接的3个是恒定的，且最后的2个是可变的。差异剪接可以造成超过1000种不同的同种型。然而，目前仅己识别了数十种天然存在的变体。

CD44标准糖蛋白由N-末端胞外(包括20个氨基酸的前导序列和近膜区(85个氨基酸))结构域(270个氨基酸)、跨膜区(21个氨基酸)和胞质尾(72个氨基酸)组成。胞外区还在N-末端包含连接部分。该区域有92个氨基酸的长度且显示出与其它HA结合连接蛋白的同源性。在小鼠型和人型CD44之间存在高同源性。蛋白的变体形式被插入外显子5的羧基末端且在表达时位于胞外。

CD44的血清可溶形式也天然地存在且能够由终止密码子(在可变区内)或蛋白水解活性产生。通过各种刺激包括TNF-α对细胞的激活造成cD44受体的释放(shedding)。在肿瘤细胞中也观察到受体的释放且该释放可导致CD44在人血清中的浓度增加多达10倍。CD44的高血清浓度暗示着恶性肿瘤(卵巢癌除外)。

CD44的标准形式以大约37kD的分子量存在。翻译后修饰将分子量增加至80-90kD。这些修饰包括氨基末端胞外结构域在天冬酰胺残基上的N-连接糖基化、在胞外结构域的羧基末端的丝氨酸/苏氨酸残基上的O-连接糖基化以及糖胺聚糖添加。剪接变体的大小可以在80-250kD范围内。

HA，一种哺乳动物中位于胞外基质(ECM)上的多糖，被认为是主要的CD44配体。然而，也已经发现CD44与诸如胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白等蛋白结合。在HA结合和糖基化之间似乎存在关联。无活性的CD44(不结合HA)具有最高的糖基化水平，有活性的CD44(结合HA)糖基化水平最低而可诱导的CD44(除非被细胞因子、单克隆抗体、生长因子等激活，否则不与HA结合或很微弱地与HA结合)的糖基化水平在活性和无活性形式之间。

CD44通过信号转导通路能够介导其的一些功能，这些通路依赖于细胞、刺激以及环境的相互作用。这样的一些通路包括NFκB信号传导级联(涉及炎症反应)、Ras-MAPK信号转导通路(涉及细胞周期和增殖的激活)、Rho蛋白家族(涉及细胞骨架重组和细胞迁移)以及PI3-K相关信号传导通路(涉及细胞存活)。上述所有的功能与肿瘤疾病的发生和发展密切相关。CD44也被暗示通过各种另外的机理在癌症中发生作用。这些机理包括CD44细胞表面存在的细胞表面蛋白聚糖将生长因子、趋化因子和细胞因子呈递给参与恶性肿瘤中的受体。同样的，在CD44-HA复合物内化后通过溶酶体透明质酸酶进行的HA的胞内降解可以潜在地增加了肿瘤入侵和通过ECM诱导血管发生的可能性。此外，已经显示存活或凋亡信号的传递通过标准的或可变的CD44受体发生。CD44也被暗示参与细胞分化和迁移。这些机理中的很多，如果不是全部，是环境和细胞依赖性的且若干机理引起了不同的发现。因此，在得出任何结论之前需要更多的研究。

为了证实CD44在癌症中潜在的功能作用，进行了CD44的表达研究以确定受体的差异性表达是否与疾病的进程相关。然而，在大部分肿瘤类型中观察到不一致的现象，且这可能是由于研究人员之间在试剂、技术、病理学评分和细胞类型上的差异的混和造成的。肾细胞癌和非霍奇金氏(non-Hodgkin′s)淋巴瘤似乎是例外，因为具有CD44高表达肿瘤的患者一致地比其低或无CD44表达的副本患者存活时间短。