[发明专利]里氏木霉α-淀粉酶是一种生麦芽糖酶

说明书

本申请要求2007年3月14日提交的美国临时申请60/906,811和2007 年3月14日提交的美国临时申请60/906,812的优先权，其中每份文件通 过引用的方式完整并入本文作为参考。

序列表

也附上了包含SEQ ID NO：1-7的序列表，其中所述序列表通过引用 的方式完整并入本文作为参考。

发明领域

提供了来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的生麦芽糖α-淀粉酶 (TrAA)、编码这种酶的核酸和包含所述核酸的宿主细胞。使用TrAA的方 法包括将淀粉糖化成富含麦芽糖的糖浆(maltose-rich syrup)。

发明背景

高果糖的玉米糖浆(HFCS)是具有高果糖含量和与糖可比甜度的加工 形式的玉米糖浆，从而使得利用HFCS作为软饮料和其他加工食品中的糖 替代物。HFCS目前代表一项十亿美元的产业。产生HFCS的方法多年来 已经从酸水解发展至一系列酶催化的反应。

(1)液化：首先使用α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)将含有30-40％w/w干燥固 体(ds)的淀粉悬液降解成麦芽糖糊精(maltodextran)。α-淀粉酶是催化随 机切割内部α-1，4-D-糖苷键的内切水解酶。因为液化一般在高温例如 90-100℃进行，所以对该步骤而言，优选热稳定的α-淀粉酶，如来自芽孢 杆菌(Bacillus sp.)的α-淀粉酶。

(2)糖化：通常使用葡糖淀粉酶和/或生麦芽糖α-淀粉酶来催化在液化 后形成的麦芽糖糊精的非还原性末端水解，释放D-葡萄糖、麦芽糖和异麦 芽糖。脱支酶如支链淀粉酶可以用来辅助糖化。糖化一般在酸性条件下在 升高的温度例如60℃，pH 4.3进行。在该过程中使用的葡糖淀粉酶一般从 真菌获得，例如在L400中使用的黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖 淀粉酶(AnGA)或灰腐质霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)。目前用于 本申请的生麦芽糖α-淀粉酶包括植物淀粉酶和来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶(澄解酶的活性成分)。糖化可以用来产生高麦芽糖或 富含葡萄糖的糖浆。

(3)异构化：当需要更甜的产物时，富含葡萄糖的糖浆可以进一步加 工以产生果糖。葡萄糖至果糖的异构化由葡萄糖异构酶催化并且产生约 42％(w/v)果糖、50-52％葡萄糖、和其他糖的混合物。额外的操作最终可 以产生例如具有42％、55％或90％果糖含量的商品级HFCS。

所述α-淀粉酶和葡糖淀粉酶直接添加至玉米糖浆的工艺批料(process batch)并且不重复利用。另一方面，将葡萄糖异构酶固定在糖混合物从中 通过的柱子上。重复使用该葡萄糖异构酶柱直至所述酶失去它们活性的大 部分。

糖化步骤是HFCS生产的限速步骤。糖化一般进行48-72小时，众多 真菌葡糖淀粉酶截至所述时间已经失去其明显活性。此外，尽管生麦芽糖 α-淀粉酶和葡糖淀粉酶均可以用来催化糖化，然而所述酶一般在不同的最 适pH和温度处操作。例如，生麦芽糖α-淀粉酶一般具有至少pH 5.0的最 适pH和低于55℃的最适温度，而AnGA一般具有pH 4.0-4.5的最适pH 和约60℃的最适温度。这两种酶在反应条件上的差异导致必需调节pH和 温度，这延缓了整个过程并且可能导致不溶性直链淀粉聚集物形成。当降 低所述pH时，将使任何残余的细菌α-淀粉酶失活；然而所述细菌α-淀粉 酶可以后来由酸稳定的α-淀粉酶替代。

理想地，该糖化步骤产生具有组成为约95-97％w/w葡萄糖、1-2％w/w 麦芽糖和0.5-2％w/w异麦芽糖的糖浆。这种富含葡萄糖的糖浆可以用于 上文步骤(3)的异构化反应中或用于产生结晶葡萄糖。这些高的葡萄糖浓度 不容易实现。例如，里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)相对于AnGA或HgGA 提供了改善的比活性；但是，TrGA产生具有一般约88％w/v最终葡萄糖 浓度的产物。此外，糖浆中的高葡萄糖浓度促使葡萄糖转化成麦芽糖和麦 芽三糖。

因此，本领域需要制备HFCS的改良方法，该方法包括使用α-淀粉酶 的糖化步骤，其中所述α-淀粉酶具有与利用真菌葡糖淀粉酶相容的最适pH 和最适温度。还需要可以在更少时间中催化糖化过程的α-淀粉酶。此外， 需要这样的α-淀粉酶，其可以实现这些目的，同时在糖化后产生具有约 96％w/w葡萄糖浓度的糖浆。