[发明专利]细胞介导的免疫应答检验及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明主要涉及用于诊断、监视或治疗的方法和试剂盒，其测量针对体外试剂(原文为“agent in vitro”，也可称为“体外因子”)的细胞应答性。具体地，本发明提供用于测量从受试者收集的小样品全血中的针对抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的系统。该方法和试剂盒将在全血样品分析中找到广阔应用，所述全血样品具有包括来自婴儿和儿童或其它受试者的一系列不同体积，其中所述样品体积是受限的或其中需要小样品体积。

背景技术

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免疫应答的功能在于消除入侵的病原体或毒素。在某些情况下免疫应答对有机体是非常破坏性的，并且存活依赖于免疫系统从非自体区分自体的能力。例如当免疫系统对自体过度应答时产生自体免疫疾病。某些免疫应答针对相对无害的非自体分子。例如哮喘和枯草热，涉及对非自体的免疫应答，其中所述免疫应答比病原因子(causativeagent)更衰弱。通常，先天的免疫系统筛选出针对非病原性有机体的应答，并且有助于防止针对此类无害试剂的适应性免疫应答。

适应性免疫应答由淋巴细胞例如执行抗体应答的B淋巴细胞或执行细胞介导的应答的T淋巴细胞来执行。B淋巴细胞产生有助于使病原体和毒素失活的免疫球蛋白。T细胞直接与呈递于宿主细胞表面上的非自体分子(抗原)反应，其与提供“自体”分子指令系统的主要组织相容性(MHC)分子有关。在两种情况下，产生对非自体分子的特定表位特异的细胞应答，并提供免疫应答网络和免疫效应子分子。

因此，用于诊断或监视感染或评价受试者建立(mount)针对非自体的免疫应答的能力的一种方法为确定受试者是否已经建立了针对抗原刺激的免疫应答。由于T细胞应答包括产生效应子T细胞，所述效应子T细胞能够对抗原应答或能够被刺激来通过产生免疫效应子分子对抗原应答，可以在体外测定应答于特定抗原的这些分子的产生，作为细胞介导的免疫应答的测定。然而，由于非自体抗原性分子通过抗原呈递细胞呈递至T细胞，存在复杂的和必须在体外成功地发生的细胞与分子的相互作用以产生用于检测的充分的免疫效应子分子。

用于检测细胞介导的免疫应答的大多数体外方法包括使用各种分离技术从全血中纯化外周血单核细胞。此类检验包括铬释放检验、细胞毒性检验、MHC I类四聚体检验、用于IFN-γ或其它细胞因子的检验，其中ELISPOT提供良好的实例。ELISPOT方法固定抗原呈递细胞，并且已经用于检测应答于抗原性刺激产生特定细胞因子的T细胞的数量。

如果使用全血，通常将其稀释于培养基中以稀释红细胞，这被认为降低该检验的敏感性。使用未稀释全血的管内细胞介导的免疫应答检验描述于国际公开No.WO 2004/042396，申请人为Cellestis Limited，在此将其全文引入以作参考。国际公开No.WO 2004/042396公开了使用血液收集管以用于样品与抗原和简单糖一起孵育，并且使用该试管系统与其中将血液转移到24-孔微量滴定板并在24-孔微量滴定板中孵育的检验相比，显示增强的敏感性。

对于人类和牲畜动物中的全血检验而言，至少从受试者中取3毫升血液，以提供充足的材料来进行细胞介导的免疫应答检验。通常通过静脉血取样、借助于经常在真空下的用针刺入收集血管来取该量。

检测免疫效应子分子的各种方法，例如酶联免疫吸附检验(ELISA)、放射免疫检验(RIA)、或血细胞计数法可以使用小体积，然而，对于进行体外细胞介导的免疫应答检验的抗原性刺激阶段的改进系统，在本领域存在需要。具体地，需要允许以小体积血液进行的全血测试的方法，例如通过外周毛细血管取样获得的那些。筛选小样品血液的能力将极大地便利儿童或其它血液可能受到限制或难于获得的受试者的取样，并且允许无需静脉采血的血液取样，其通过使用毛细血管血例如通过拇指、足跟、耳垂或其它方便位点的点刺测试(pricktest)获得的那些，并且用于测试在单次小容量抽血中(single blooddraw of low volume)的包括有丝分裂原和半抗原刺激物的多种或一系列抗原。

发明内容