[发明专利]分生组织切除和转化方法

权利要求书

1.一种用于产生转化的棉花植物组织的高通量方法，包括：

a)机械破坏棉籽以获得多个棉胚分生组织外植体；和

b)将外植体与编码可选择的或可筛选的标记的选择的DNA序列 相接触以获得由选择的DNA转化的至少第一外植体，

c)从由选择的DNA转化的至少第一外植体再生包含转基因植物 组织的嵌合棉花植物，其中转基因棉花植物的再生不包括由外植体产 生愈伤组织培养物；

d)通过将嵌合棉花植物与选择剂相接触来从嵌合棉花植物选择 转基因组织，其中可选择的标记提供对选择剂的耐受性；和

e)从步骤(d)选择的转基因组织获得非嵌合转基因棉花植物， 从而获得转化的棉花植物组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在进行(b)步骤之前， 所述外植体贮存在0-15℃温度下1小时至7天。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非嵌合转基因棉花植 物是通过导致种系组织转化的分生组织的转化产生的。

4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括在外植体与选择的 DNA序列接触之前筛选外植体，以确认适合用选择的DNA转化和由 其再生转基因植物的一部分外植体。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，筛选外植体包括将包含外 植体的机械破坏的棉籽置于水性环境中，并根据浮力选择将与选择的 DNA接触的外植体。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，筛选外植体包括筛分机械 破坏的棉籽以从种皮或子叶组织中分离出外植体。

7.根据权利要求4所述的方法，其中，筛选外植体包括富集适合 转化的外植体部分。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述选择的DNA序列编 码所述标记，或确定一种农学性状。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中的外植体包 含转基因。

10.根据权利要求8所述的方法，进一步包括通过将外植体与选 择剂相接触来选择或筛选由选择的DNA转化的外植体，其中，可选 择的标记提供对选择剂的耐受性；或在可筛选的标记的存在下通过将 外植体与产生可筛选表型的试剂相接触来选择或筛选由选择的DNA 转化的外植体。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，转基因棉花植物组织是 由分生组织的转化产生的。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，转基因外植体的选择或 筛选包括将外植体与选择剂或产生可筛选表型的试剂相接触，该选择 剂或产生可筛选表型的试剂选自草丁膦、麦草畏、草甘膦、壮观霉素、 链霉素、卡那霉素、G418、巴龙霉素、咪唑啉酮、GUS的底物及其 组合。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，机械破坏棉籽包括使种 子通过碾碎种子的轧辊。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述轧辊包含次级凹槽。

15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述轧辊由不锈钢制成。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，外植体与选择的DNA 序列的接触包括将外植体与能够用选择的DNA至少转化外植体第一 细胞的重组根瘤菌或土壤杆菌相接触。

17.根据权利要求16所述的方法，包括将外植体与生长至0.0045 到1.4的OD660的重组土壤杆菌培养物相接触。

18.根据权利要求16所述的方法，包括将外植体与土壤杆菌培养 物相接触，其中，棉花分生组织与土壤杆菌细胞接触的pH为5.0至 10.0。

19.根据权利要求16所述的方法，其中，在外植体与重组根瘤菌 或土壤杆菌相接触之前，根瘤菌或土壤杆菌在对未转化的外植体有活 性的选择剂存在下悬浮。

20.根据权利要求1所述的方法，其中，外植体与选择的DNA 序列的接触包括通过微粒轰击转化外植体。