[发明专利]分生组织切除和转化方法

说明书

背景技术

本申请要求于2007年3月9日提交的美国临时申请60/894,096 和于2007年4月30日提交的60/915,066的优先权，在此其全部公开 内容都通过引用方式结合于本文中。

1.发明领域

本发明主要涉及制备和转化棉花分生植物组织的方法以及后续 的转基因植物的再生。

2.相关技术描述

可以通过将异源DNA转移到植物胚的分生组织来获得转化的植 物。分生组织包含形成性植物细胞，形成性植物细胞可以分化产生多 种植物结构，包括茎、根、叶、种系组织和种子。可以处理和选择或 筛选植物分生组织，以确定这些处理过的分生组织中哪些已将新的遗 传信息引入种系组织中。美国专利6,384,301和7,002,058以及美国公 布20060059589描述了直接对大豆胚的分生组织细胞应用细菌介导的 基因转移来遗传转化大豆(Glycine max)的方法。美国公布 20050005321描述了从种子中切下大豆分生组织。分离的棉花分生组 织和幼苗顶端组织已经被转化(例如WO9215675；美国专利5,164,310； McCabe和Martinell，1993)。但是，由于棉籽的物理和生理性质，为 获得转基因植物而切除分生组织材料和转化的条件与大豆的不同。

目前从吸胀(imbibed)的棉籽中切除胚的手工过程是缓慢的，并 且具有人工负担(ergonomic burden)。在这一过程中，戴上手套， 一次一个地对表面灭菌的种子进行无菌操作。然后小心切下外植体。 对于棉花分生组织，仔细地将种子定向，以使用施加的力弹出胚。但 是即使小心处理每个种子，可用胚的回收率仍然通常较低。

切下之后胚的细菌污染也是一个重要的考虑方面。为保持外植体 的较高生命力和回收率而增加的处理也增加了破坏性污染的可能性 (这将会在后面的操作步骤中表现出来)。这样的污染会导致显著的损 失，因为一个污染的外植体会在转化和组织培养过程中污染其它样 品。这会导致产率和/或转化频率的降低。而且，手工切除过程是极其 劳动密集和耗费时间的，并且为转化过程的规模扩大化设置了障碍， 在这种扩大化中许多植物一般必须要经过处理来达到理想的结果。因 此，迫切需要能够在不会不可接受地增加总费用和/或用于转化的外植 体制备时间的同时增加可转化棉胚的可获得性的方法。

发明概述

一方面，本发明提供了一种用于产生转化的棉花组织的高通量方 法，包括：a)机械破坏棉籽以获得多个棉胚分生组织外植体；和b) 将外植体与选择的DNA序列相接触以获得由选择的DNA转化的至少 第一外植体。在某些实施方案中，在与选择的DNA序列相接触之前， 外植体储存在0-15℃温度中1小时至7天。在另一些实施方案中， 该方法进一步包括由至少第一外植体再生被选择的DNA转化的转基 因棉花植物的步骤。在某些实施方案中，该方法不包括由外植体产生 愈伤组织培养物。

在特定的实施方案中，转基因棉花植物是经导致种系组织转化的 分生组织转化产生的。在某些实施方案中，产生的植物为非嵌合的。 在可替代的实施方案中，产生的植物是嵌合的。

在某些实施方案中，该方法进一步包括在外植体与选择的DNA 序列接触之前筛选外植体，以确认适合用选择的DNA转化并由其再 生转基因植物的部分外植体。在另外的实施方案中，筛选外植体包括 将包含外植体的机械破坏的棉籽置于水性环境中，并根据浮力选择将 与选择的DNA接触的外植体。在另一些实施方案中，筛选外植体包 括筛分机械破坏的棉籽以从种皮和子叶组织中分离出外植体。筛选外 植体也可以富集适合转化的外植体部分。