[发明专利]检测核酸序列的方法

权利要求书

1.一种对包含在样品里的一个或多个靶核酸中的至少一个变异核苷酸进行检测的方 法，所述方法包括：

（a）使用与靶核酸序列第一区域互补的第一寡核苷酸引物和与靶核酸序列第二区域 互补的第二寡核苷酸引物处理样品，以形成二聚体的混合物，所述二聚体包括在杂交条件 下与靶核酸退火的第一和第二寡核苷酸引物，

其中所述第一引物的核苷酸序列与靶核酸的所述第一区域充分互补，而且其中所述第 一区域是包含疑似变异核苷酸的诊断区域；

其中所述第二引物的核苷酸序列与靶核酸的所述第二区域充分互补，而且其中靶核酸 的第二区域位于靶核酸第一区域的3’端，并且

其中所述第一引物的3’末端核苷酸或与3’末端核苷酸相距1、2或3个核苷酸的非 末端核苷酸与疑似的变异核苷酸互补，并且第一引物含有标记，其中当第一引物与包含疑 似变异核苷酸的靶区域退火时，退火的第一引物能够延伸，其中当第一引物与包含正常核 苷酸的靶区域退火时，退火的第一引物不能延伸；

（b）将步骤（a）的混合物置于包含适当的三磷酸核苷酸和核酸聚合酶的延伸条件下， 延伸退火的第一引物和第二引物，若能延伸，合成第一引物和第二引物的延伸产物；以及

（c）将步骤（b）的混合物置于降解条件下，所述降解条件包括核酸外切酶活性，由 此若第一引物的延伸产物存在，则第二引物的延伸导致所述第一引物的延伸产物在降解条 件下被降解，从而生成表示靶核酸里变异核苷酸的可检测信号；

若第一引物的延伸产物未被产生，在延伸条件下，所述退火的第一引物从所述第一区 域解离，从而在降解条件下第一引物的延伸产物的降解不会发生，从而不会产生可检测信 号，表示靶核酸里变异核苷酸的不存在；

其中步骤（a）、步骤（b）和步骤（c）是PCR反应的部分。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的疑似变异核苷酸是SNP或者突变的核苷 酸。

3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的方法，其中所述的降解以模板依赖的 降解方式进行。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸酶活性是5’→3’核酸外切酶活性。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的5’→3’核酸外切酶活性由DNA聚合酶提 供。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的DNA聚合酶与步骤（b）中使用的酶相 同。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种所述的三磷酸核苷被标记，由此第一 引物延伸产物的降解产生可检测信号。

9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤（a）进一步包括使用与靶核酸序列第一区 域互补的至少两类第一寡核苷酸引物处理样品，从而形成二聚体混合物，所述二聚体包含 在杂交条件下与靶核酸退火的第一寡核苷酸引物，

其中所述的第一引物的核苷酸序列与靶核酸的所述第一区域充分互补，

而且其中所述的第一引物的第一类型的3’末端核苷酸与疑似的变异核苷酸互补，

而且其中所述的第一引物的第二类型的3’末端核苷酸与相应的正常核苷酸互补，

由此在步骤（b）里，当所述的第一引物的第一类型与包含靶核酸序列里的疑似变异 核苷酸的第一区域退火时，第一引物的第一类型的延伸产物被合成，但是当所述的第一引 物的第一类型与包含靶核酸序列里相应的正常核苷酸的第一区域退火时，延伸产物则不能 被合成，

而且由此在步骤（b）里，当所述的第一引物的第二类型与包含靶核酸序列里的正常 核苷酸的第一区域退火时，第一引物的第二类型的延伸产物被合成，但是当所述的第一引 物的第二类型与包含靶核酸序列里相应的变异核苷酸的第一区域退火时，延伸产物则不能 被合成。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一引物的第一类型和第二类型是可以降 解的。