[发明专利]检测核酸序列的方法

说明书

技术领域

本发明涉及到检测和/或定量包含在待测样品里的靶核酸或者一个或多个变异的核苷 酸序列的方法。

发明背景

单核苷酸多态性(SNPs)是人类基因组变异中最常见的类型。突变也通常是SNPs， 但是一般认为这个术语专指频率低于1％的变异或者指已知的功能性的、致病的变异 (Gibson NJ，2006，临床化学学报(Clin Chim Acta.)363(1-2)：32-47)。基因分型多态性 和稀有突变的检测有许多应用。稀有变异的检测对病理突变，特别是癌症的早期检测，有 重要意义。例如，对临床样本癌症相关的点突变的检测能够提高对化疗期间微小残留病变 的鉴定，而且能够检测复发病人出现的肿瘤细胞。突变负荷的测定对于评估诱变剂的环境 暴露、监测内源DNA的修复、研究老年人体内突变的累积也很重要。此外更多灵敏、定 量的方法应用于稀有变异的检测，能够引发产前诊断的革命，而且能够鉴定母体血液内的 胎儿细胞。已经引进许多方法，但是没有一种方法被广泛接受。许多检测基因组DNA里 的低频率变异的方法使用聚合酶链式反应(PCR)以扩增突变体和野生型的靶DNA。然 后，使用包括测序、寡核苷酸的连接、限制性酶切、质谱或等位基因特异性寡核苷酸的杂 交在内的多种方法对PCR产物进行分析，以鉴定出野生型DNA背景中的变异。其它方法 则采用等位基因特异性PCR选择性地扩增低频率变异核酸，包括或不包括进一步的选择 步骤。例如，使用一种特异裂解野生型产物的限制性酶消化PCR产物。由于在PCR过程 中缺少等位基因特异引物的全部特异性，现有方法存在产生假阳性的固有缺陷。因此，现 有的所有方法在灵敏度和精确性上受到限制(综述参见Jeffreys AJ和May CA，2003基因 组研究(Genome Res.)13(10)：2316-24)。

实时聚合酶链式反应(PCR)可以被用于SNP基因分型。它可在联通管(closed-tube format)里进行操作，而且可以量化。目前有几种方法用于实时PCR，例如使用TaqMan 探针(美国专利5210015和5487972，Lee等，Nucleic Acids Res.21：3761-6，1993)，分 子信标(美国专利5925517和6103476，Tyagi和Kramer，Nat.Biotechnol.14：303-8，1996)， 自杂交扩增子(蝎状引物)(美国专利6326145，和Whitcombe等，Nat.Biotechnol.17：804-7， 1999)，Amplisensor探针(Chen等，Appl.Environ.Microbiol.64：4210-6，1998)，Amplifluor 探针(美国专利611763，Nazarenko等，Nucleic Acids Res.25：2516-21，1997)，置换探 针(Li等，Nucleic Acids Res.30：E5，2002)，DzyNA-PCR法(Todd等，Clin.Chem.46：625-30， 2000)，荧光限制性酶检测(Cairns等，Biochem.Biophys.Res.Commun.318：684-90，2004) 和邻近杂交探针(美国专利6174670，Wittwer等，Biotechniques 22：130-1，134-8，1997)。 然而，由于精确性低，这些方法通常不适于突变检测。

检测稀有变异的所有这些PCR方法背后的共同问题为扩增或不严谨的探针杂交过程 中的失真的复制。这点明显存在于Newton等人描述的受欢迎的突变检测方法中(Nucleic Acids Res.17：2503-16，1989；美国专利5595890)。这个系统，即扩增阻滞突变系统(ARMS)， 使用等位基因特异引物用于PCR反应。扩增中的引物错配通常会导致不精确的结果。

EP0663447涉及到一种关于检测多聚核苷酸的方法。在该方法里，使用与部分所述的 多聚核苷酸互补、具有核酸酶抗性的寡核苷酸引物，与已知核苷酸序列的多聚核苷酸杂交， 然后加入至少一种三磷酸脱氧核苷、DNA聚合酶和核酸酶，以合成一条定位于邻近所述 引物的3′末端、与所述多聚核苷酸互补的核苷酸互补链，在互补链的分解之后，所述互补 链的合成和分解重复一至多次，以检测产生的焦磷酸和一磷酸脱氧核苷。

但是，应了解提供精确和灵敏的核酸检测方法将为此项技术作出贡献。

发明的公开