[发明专利]细胞培养方法、细胞培养体系及培养基调整装置

说明书

技术领域

本发明涉及使用密封的培养容器的细胞培养，特别涉及调整追加的培 养基的溶存气体量及pH使培养环境保持最佳状态的细胞培养方法、细胞 培养器械及培养基调整装置。

背景技术

近年，在人工环境下培养细胞或组织、微生物等的细胞培养技术发展， 正积极应用于生物医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等医疗 领域。

该细胞培养技术已经实际应用于生产单克隆抗体或再生皮肤等必须 有效培养大量细胞的多个方面，成为极重要的技术。

在上述情况下，为了大量有效地培养细胞，以往提出了各种细胞培养 装置。

例如，专利文献1记载的细胞培养用具在容器主体设置有细胞培养袋 和用于阻止培养袋中的培养液流通的阻止部件，使用该阻止部件分隔培养 区域，随着细胞增殖能阶段地扩张培养区域。

通过使用上述细胞培养用具，可以从培养起始至其结束时刻在同一培 养袋内继续培养。

另外，专利文献2记载的用于生物体外增殖的装置具有具有培养空间 的细胞培养亚分区室的连续列与能可变地释放且隔断亚分区室间液体连 通的调整构件，随着细胞增殖，阶段地扩张培养区域。

由此，可以提供适合确保细胞存活的小规模的起始环境与增大规模的 环境，可以在没有转移污染危险的情况下经济且省时地培养高细胞数集 团。

进而，专利文献3记载的培养容器是培养沿着底面生长的细胞的培养 容器，能对应细胞生长扩大底面的面积。

由此，能在单一容器内有效地增殖细胞。

但是，上述现有的细胞培养装置中，关于在培养区域扩张时追加的培 养基并没有进行特别研究。

例如，专利文献1记载了下述内容：如果在被第一阻止部件分隔的培 养区域内，细胞增殖至所希望的程度的话，用第二阻止部件分隔袋，此时， 与培养细胞的增殖能力相对应地确定培养基的量，使培养区域扩张时的细 胞密度维持在适当的范围内。并且记载了通常确定培养基的量使培养开始 时或培养区域扩张时的细胞密度为1×10⁵个/ml左右，并且根据使用的细胞 种类和增殖特性或培养目的来适当设定细胞密度即可。

另一方面，专利文献1中，并没有明确记载如何调整追加的培养基成 分，考虑追加最适合用于最初培养基的培养基。

但是，由于随着细胞增殖，培养基环境慢慢变差，所以追加与最初的 培养基相同条件的培养基时，刚追加后的培养环境虽然提高，但无法维持 最初的培养基环境。

即，细胞增殖的结果是，培养基的溶存氧量降低，溶存二氧化碳量增 加。另外，因产生乳酸等，培养基的pH慢慢降低。即使在上述培养基中追 加例如相同量的与最初培养基相同条件的培养基，也无法使培养基整体恢 复到最初的最佳环境。

上述问题在实施专利文献2及3记载的发明的情况下也同样发生。

专利文献1记载了下述内容：将袋放入碳酸气体培养器内，在培养所 需的气体气氛下静置培养，培养温度、培养时间、pH、二氧化碳浓度等条 件根据使用的细胞设定。

另外，专利文献2记载了下述内容：当在最初的亚分区室中达到细胞 生长和存活性的界限时，将内容物(细胞、培养基)转移到后续连续的亚分 区室，在后续亚分区室内中，利用加入其中的培养基和容量等提供来自最 初的亚分区室的细胞集团保持存活力同时进一步增加所需的必要条件。

进而，专利文献3中记载了下述内容：通过将混合的间充质干细胞和 培养基维持在规定的温度及二氧化碳浓度等的培养条件，经规定时间，在 一定培养条件下细胞被二次培养。

认为上述现有技术中，如上所述，没有考虑追加的培养基的成分条件， 追加与最初的培养基相同条件的培养基，随后调整温度和CO₂浓度等培养 条件。

专利文献1：日本特开2000-125848号公报

专利文献2：专利第2981684号公报

专利文献3：日本特开2004-89136号公报

发明内容

但是，仅用上述方法事实上无法适当改善因细胞增殖而变差的环境， 难以将培养基的pH和溶存二氧化碳量、溶存氧量等的环境常维持在最佳状 态。

另外，即使参照其他现有技术文献，也没有记载在密封的培养容器下 的细胞培养中，能将培养环境保持在最佳状态的技术。