[发明专利]有条件的且可诱导的转基因表达来指导干细胞发育的方法

说明书

对相关申请的引用

本申请要求2007年3月9日提交的共同待决美国临时申请号 60/690,169、标题为“有条件的且可诱导的转基因表达来特异性和精确地 指导胚胎细胞、胚胎干细胞和前体细胞的发育的新方法”的优先权，其 公开内容通过引用被合并在此。

背景技术

本公开涉及体外或体内以排他方式指导胚胎细胞、胚胎干细胞、前 体细胞和诱导的多能干细胞(EC/ES/P/iPS)向任何细胞类型、组织或器 官系统发育的方法，特别是用于嵌合体的创造。

人类和小鼠基因组序列一同创造了前所未有的机会来开发新的、遗 传工程化的动物模型，以加快新的治疗方式的开发来解决和减轻由于疾 病而引起的人类痛苦和受难。EC/ES/P/iPS细胞的分化程序是生物学中 的中心问题之一。此外，组织特异性干细胞的分离代表了潜在的强大机 会来开发有效的治疗剂以帮助受损或患病器官的修复。更快速地发现癌 症、心血管疾病、糖尿病和其他灾难性人类疾病的有效预防和治疗的最 好的希望是通过人类健康和疾病的增强的动物模型。

器官移植是许多人类疾病，例如，晚期的肾、肝、心脏和肺部疾病 中公知的和接受的救命手术。从医学和经济学的角度看，器官移植常常 优于可选择的治疗形式。但是，供体器官的数量不足限制了这种技术的 应用，当其他的手术被证明不成功时，可能导致不必要的生命损失。一 些实验技术，例如异种移植，对于开发创造器官可用性的新方法变得越 来越重要。

在过去的几年中，已经分离了几种类型的EC/ES/P/iPS细胞，在体 内和体外测试了它们的分化潜力。然而，这些早期研究都没有了解这样 的干细胞和祖细胞作为正常发育的一部分的“真实的”生理学结局。几年 前，开发了新的细胞作图系统，其基于在干细胞或祖细胞群体中表达 Cre或Flp的重组酶。参见Dymecki和Tomasiewicz，Dev.Biol.201：57-65 (1998)；Gu等人，Development 129：2447-2457(2002)；和Zinyk等 人，Curr.Biol.8：665-668(1998)。报告基因构建体中Cre介导的“floxed” 序列(即，loxP侧翼的终止序列)切除、或Flp介导的FRT侧翼序列切 除显示了在所有后裔细胞中产生持久的报告基因表达。由于Cre或Flp 可以通过使用小鼠中的干细胞(或祖细胞)特异性启动子和/或增强子元 件被以转基因方式导入这些细胞中，这种策略允许分析这些前体细胞在 体内复杂器官系统中细胞生命中的命运。这种新的基于重组的命运作图 系统的能力的很好例子是小鼠中Flk1⁺细胞的命运鉴定，证明了Flk1⁺细胞也展现了对内皮细胞外的其他中胚层系统的分化潜力。参见， Motoike等人，Genesis 28：75-81(2003)。

Matsumura等人(2004)报道了具有用来表达DT的谱系的特异性 的细胞破坏系统的新转基因小鼠模型，其在没有Cre重组酶的共表达的 情况下是沉默的和无害的。当将这种小鼠与谱系/细胞特异性Cre表达小 鼠起培育时，提供了用于多种研究的模型，所述研究探寻DT活化产生 的特定细胞类型消融的结果。参见，例如Brockschnieder等人，Genesis 44：322-327(2006)和Kisanuki等人，Developmental Biology 230，230-242 (2001)。然而，这些有条件的基因靶向系统具有许多限制，因为它们 不是空间可控制的就是时间可控制的，但不同时是这两种。

人类雌激素受体的突变的配体结合结构域也由Metzger和Chambon (2001)融合到Cre重组酶。在用这种修饰产生的转基因小鼠系中，Cre 重组酶的核定位导致了他莫昔芬依赖性的行为。这些小鼠被用于产生细 胞/器官特异性的空间-时间受控制的体细胞突变。该系统还用于在干细 胞分化研究中富集期望的细胞类型。