[发明专利]细胞培养物中因子Ⅷ多肽滴度的提高

说明书

发明领域

本发明涉及一种生产因子VIII多肽的方法，包括使用C2结构域配 体，尤其是O-磷酸-L-丝氨酸(OPLS)。

发明背景

典型的血友病或血友病A是一种遗传性出血疾病。它源于与染色 体X有关的血液凝结因子VIII缺陷，并且几乎只影响男性，发病率 为每10,000人中1到2例。X染色体缺陷由自身不是血友病患者的女 性携带者传播。血友病A的临床表现是出血倾向的增加。在利用因子 VIII浓缩物的治疗被引入前，患有严重血友病的人的平均寿命低于20 年。使用来自血浆的因子VIII浓缩物显著改善了血友病患者的情况， 广泛地增加了平均寿命，使他们中的大多数能够过上或多或少正常的 生活。但是，在血浆来源的浓缩物和它们的使用中存在某些问题，其 中最严重的问题是病毒的传播。到目前为止，造成AIDS、乙肝和非 甲非乙型肝炎的病毒已经严重影响人群。从那时起不同的病毒灭活方 法和新的高度纯化的因子VIII浓缩物近来已被开发出来，这也为血浆 来源的因子VIII确立了非常高的安全标准。

已知因子VIII(FVIII)在哺乳动物细胞中以非常低的水平表达。并 且已知在无血清或无蛋白的培养基中因子VIII是不稳定的蛋白。各种 物质的添加已经被用于提高因子VIII的稳定性和滴度。

WO 9743436公开了添加金属依赖性抑制剂和/或糜蛋白酶的抑制 剂。

WO 88/08035和WO 87/04187公开了向因子VIII培养基中添加磷 脂。还描述了von Willebrand因子(vWF)的共表达。

US 20050227913A1公开了OPLS通过结合C2结构域(2303-2332) 而作为因子VIII聚集的抑制剂。聚集更少的因子VIII据称免疫原性 更低。

K.Hansen，M.Kjalke，P.B.Rasmussen，L.Kongerslev，和M.Ezban， Cytotechnol.24(3)，227-234，1997，公开了使用杆菌肽A和磷脂酰丝 氨酸来阻止培养基中因子VIII的降解。

WO 90/02175A1公开了在存在蛋白酶抑制剂以阻止多肽降解的 条件下，通过培养真核细胞生产重组多肽的方法。

EP 1707634A1公开了相当大量的因子VIII缔合在细胞表面，可 以通过用高离子强度的缓冲液清洗将其洗脱。

因此，仍然需要改进的生产方法以便提高因子VIII多肽的总产率 和/或降低生产成本。

发明概述

本发明的第一个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方 法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达 因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含C2结构域配 体的细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因 子VIII多肽。

本发明的第二个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方法，所述方 法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件下培养表达 因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括细胞培养基，和 b)通过合适的方法从哺乳动物细胞分离表达的因子VIII多肽，所述合 适的方法包括向所述细胞添加C2结构域配体。

附图简述

图1.因子VIII基因序列(cDNA)(SEQ ID NO.1)。

图2A-B：O-磷酸-L-丝氨酸对FVIII生产率和FVIII蛋白比活性的 影响。

图3A-C.O-磷酸-L-丝氨酸和/或植物蛋白水解物对因子VIII生产 细胞的培养基中因子VIII的影响。条件A-D的特性显示于表4。

发明详述

如上所述，本发明的第一个方面涉及一种生产因子VIII多肽的方 法，所述方法包括以下步骤：a)在用于表达所述因子VIII多肽的条件 下培养表达因子VIII多肽的哺乳动物细胞，所述培养条件包括包含 C2结构域配体的细胞培养基，和b)通过合适的方法从哺乳动物细胞 分离表达的因子VIII多肽。