[发明专利]用于细胞维持、扩增和/或分化的透明质酸、其他基质成分、激素和生长因子的复合物

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2007年3月6日提交的美国临时申请第60/893,277号的优先权，通过引用将该申请公开的内容全部并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及细胞(例如包括肝祖细胞在内的肝细胞)的维持、扩增和/或分化。更具体地，本发明涉及具有其他细胞外基质成分、激素和生长因子且被用作用于细胞的维持、扩增和分化的支架的透明质酸(hyaluronan)复合物，所述细胞包括祖细胞亚群，例如肝干细胞、成肝细胞(hepatoblast)、定向祖细胞以及它们的后代细胞。

背景技术

先体外后体内的细胞维持取决于营养物、特异性细胞外基质成分的底物以及包括激素和生长因子的可溶性信号物的混合物的使用。营养物、基质成分和水溶性信号物的独特的确定成分混合物(defined mixture)诱发细胞的生存、扩增和分化。而且，确定成分混合物的成分与干细胞(相对于谱系中的过渡细胞(intermediate)且相对于成熟细胞)所需的特异性成分是谱系依赖性的。以透明质酸复合的混合物提供天然的三维(3-D)信号支架，该信号支架的坚固性程度除了基础基质分子之外还由交联形式调节，并且该混合物都为先体外后体内的组织工程和将被再引入至动物(或人)体内的细胞移植物的形式提供相当大的优势。这些复合物对于干细胞(例如肝干细胞和它们的后代细胞(如成肝细胞和定向祖细胞))也很有用，所述干细胞可被建立在由确定成分混合物构成的复合物中以诱发急剧的三维扩增，或者所述干细胞可被接种进驱动三维分化的复合物中。对于包括生物人工肝或细胞移植在内的基于细胞的疗法而言，干细胞是合乎需要的候选细胞。这种技术应当有助于所述疗法，尤其是对于实体器官的细胞而言，在实体器官的细胞中，移植方法对于细胞的体内再引入可能是特别重要的。

需要一种实现干细胞的显著扩增的条件。这是由可从正常组织中分离的少数干细胞来决定的。相反，先体外后体内的组织工程或者细胞疗法的临床程序需要大量的细胞以达到预期的目标。因此，迫切地需要允许干细胞自身更新和/或大量增殖后继续分化的技术。

发明内容

在一种实施方式中，本发明提供了一种先体外后体内维持、繁殖和/或分化肝细胞(包括祖细胞)的方法，该方法包括：(a)提供细胞(例如肝祖细胞)的悬浮液；以及(b)在无血清培养基中并在具有或不具有其他细胞外基质成分以及具有或不具有激素或者生长因子的透明质酸的复合物上培养细胞，其中基质成分和激素/生长因子的精确混合有利于细胞群(可为祖细胞或成熟细胞)的1)维持；2)自身复制(也称为自身更新)；3)扩增(不包括自身更新)和/或3)分化。祖细胞可以是干细胞(例如，肝干细胞)、短暂扩增细胞(例如成肝细胞(肝脏的候选短暂扩增细胞))和/或定向(单能)祖细胞(例如定向肝祖细胞或定向胆祖细胞)。

所述细胞外基质可进一步由与胶原蛋白(例如I型、III型、IV型或V型胶原蛋白)、基底粘附分子(例如层粘连蛋白或纤连蛋白)、蛋白聚糖或它们的糖胺聚糖链(例如肝素蛋白聚糖或肝素)和/或激素(例如胰岛素)或生长因子(例如表皮生长因子)复合的透明质酸组成。在某些实施方式中，透明质酸通过例如醛桥或者二硫桥而被化学交联。

本发明的细胞是从胎儿组织、新生儿组织、儿童组织或者成人组织中获得的。无血清培养基可包含胰岛素、转铁蛋白、其他激素(例如三碘甲腺原氨酸、生长激素、胰高血糖素、皮质醇)、微量元素(例如锌、铜、硒)、生长因子(例如表皮生长因子或EGF、成纤维细胞生长因子或FGF、白血病抑制因子或LIF)或混合物；并且在某些实施方式中，无血清培养基可主要由胰岛素、转铁蛋白、脂类和微量元素组成，或者可主要由胰岛素、转铁蛋白和脂类组成。进一步地，对于上皮细胞而言，在培养基中的钙浓度可以从适于扩增的浓度(＜0.5mM)变化至适于分化的浓度(＞0.5mM)。最后，无血清培养基可不含任何生长因子或除胰岛素和转铁蛋白之外的任何激素。

此外，本发明的透明质酸复合物可用于先体外后体内的组织工程。例如，所述复合物可被用作移植物的支架而用于体内细胞移植。