[发明专利]评估细胞和细胞培养物的方法

说明书

相关申请

本申请要求2007年4月6日提交的临时申请60/910,574的优先权，通过提 及而收录其全部内容。

发明领域

本发明涉及测定细胞培养物组成的方法，更具体地，涉及区分软骨细胞 与成纤维细胞的方法。

发明背景

关节软骨损伤具有较差的修复速率，这部分由于软骨组织中缺乏血液供 给(Basad等，于：Hendrich等，Cartilage Surgery and Future Perspectives，Thieme Verlag，49-56(2003))。膝关节创伤能导致例如软骨和骨软骨损伤，而且此类 损伤可发展成骨关节炎(Brittberg等，New England Journal of Medicine，331 (14)：889-895(1994))。在骨关节炎的严重病例中，可能需要全膝置换。然而， 膝置换中所使用的人工假肢具有有限的寿命，如此膝置换不是最佳的治疗 法，特别是对于非老年患者(Brittberg等，见上文)。

在一些情况中，关节软骨损伤可以通过自体软骨细胞植入来修复 (Brittberg等，Clin.Orthopaed.Rel.Res.，367S：S147-S155(1999))。在这种规程 中，从患者收获软骨细胞，在细胞培养中扩充以增加软骨细胞的数目，然后 回植入该患者的损伤部位中。用一片骨膜组织覆盖软骨细胞以将软骨细胞密 封入损伤部位中。虽然所培养的软骨细胞在培养中具有去分化的趋势，但是 在成功的植入物中，去分化的软骨细胞保持其再分化潜力，而且会在植入后 再分化成产生透明软骨组织的软骨细胞。

在一种称为基质诱导的自体软骨细胞植入的改良技术(植入规 程)中，将培养的软骨细胞加载至胶原基质上，然后将它们植入患者中(Basad 等，见上文)。另外，胶原基质可以用血纤蛋白胶而非通过缝合来固定，使其 成为更简单的手术技术。

可使用不同的技术和培养基来培养软骨细胞。供软骨细胞培养用的无血 清培养基的例子及用于分离和增殖软骨细胞的方法记载于例如美国专利号 6,150,163和7,169,610，及美国临时专利申请号60/805,307，本文通过提及而 将它们收录。

成纤维细胞或成纤维细胞样细胞(诸如滑膜细胞)可以与软骨细胞共分 离，如此在制备软骨细胞植入物的过程中在细胞培养物中共增殖。已知软骨 细胞在它们在培养中去分化时呈现成纤维细胞的外观(Benya和Shaffer，Cell， 30：215-224(1982))。不过，它们维持其分化潜力，即它们能够在植入后再表 达软骨细胞表型。因此，根据外观区分所培养的去分化软骨细胞与共培养的 成纤维细胞或成纤维细胞样细胞会是困难的。

另外，培养的去分化软骨细胞中的基因表达样式不同于天然软骨软骨细 胞的基因表达样式。例如，天然软骨软骨细胞中高度表达的许多标志物在所 培养的软骨细胞中以降低的水平表达(Binette等，J.Orthopaed.Res.，16： 207-216(1998))。因而，这样的软骨细胞标志物的表达可能未必能区分去分 化的软骨细胞与可在细胞培养物中存在的其它类型的细胞。此外，许多已知 的成纤维细胞标志物在去分化软骨细胞和天然软骨软骨细胞两者中均表达， 尽管处于不同水平。因而，这样的成纤维细胞标志物的表达水平可能未必能 指明样品中所存在的细胞是去分化软骨细胞、成纤维细胞、还是成纤维细胞 样细胞。

需要鉴定软骨细胞、成纤维细胞和成纤维细胞样细胞的方法，特别是适 用于细胞培养的方法。

发明概述