[发明专利]调节LRRK2的方法

说明书

方法

近期的发现已经引起很大的兴趣：在编码富含亮氨酸重复的蛋白激酶-2 (LRRK2)的基因中的不同常染色体显性点突变使人类倾向于发生晚发的帕金森 病(PD，OMIM登记号码609007)，其具有与原发性PD不能区分的临床征候[1-4]。 截至目前进行的遗传分析显示，LRRK2中的突变是相对频繁的，不只占家族型PD 的5-10％，还被发现占偶发PD病例的重要比例[5，6]。很少知道LRRK2是如何在 细胞中被调节的，什么是其生理性底物，LRRK2中的突变是如何造成或增加PD 风险。在哺乳动物中有2种LRRK蛋白激酶的亚型：LRRK1(2038残基)和LRRK2 (2527残基)。它们属于也被称作Roco的蛋白家族[7]。迄今，LRRK2中的突变， 而不是LRRK1中的突变，已经与PD联系上。

蛋白激酶的LRRK/Roco类最初在黏菌网柱菌slime mould Dictyostelium discoideum中被鉴定为称作GbpC(cGMP结合蛋白C)的蛋白，其含有Ras/GTPase 超家族的罕见成员，与其它小GTPase结构域不同，因为其具有包括蛋白激酶的其 它结构域[7，8]。随后的研究提示，在网柱菌属中，GbpC调节趋化性(chemotaxis) 和细胞极性[9]，但是该酶的生理性底物还未被阐明。LRRK/Roco-蛋白的定义 (defining)特征是其具有富含亮氨酸重复(LRR)的基序、Ras-样小GTPase、高 氨基酸保守区(被称为复合物的Ras的C-末端(COR)结构域(C-terminal Of Ras of complex(COR)domain)和蛋白激酶催化结构域[7，10]。LRRK2的蛋白激酶结构 域属于酪氨酸样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶并且与Rho-相互作用蛋白激酶(RIPK)最 相似，RIPK在先天的免疫信号通路中扮演重要角色[11]。在LRRK激酶的特异成 员中还发现其它结构域。例如，GbpC具有另一个DEP、环GMP-结合和Ras-GEF 结构域，其没有在哺乳动物LRRK1和LRRK2中发现。人类LRRK1具有在其N- 末端的3个锚蛋白重复，而LRRK2缺少这些结构域，但是具有未在LRRK1中发 现的定位于其C-末端的一个WD40重复[7]。

人类LRRK2包含富含亮氨酸重复(残基1010-1287)、小GTPase结构域(残 基1335-1504)、COR结构域(残基1517-1843)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域(残 基1875-2132)和与WD40重复有低相似性的基序(2231-2276)。迄今，～20单氨 基酸置换性突变已经与常染色体显性PD联系起来，且已经发现这些突变是在小 GTPase、COR、蛋白激酶和WD40结构域的保守残基当中或与它们很接近[3，4]。

占欧洲家族型PD的～6％和偶发性PD病例的3％的LRRK2最流行的突变形式 包括在激酶结构域的亚结构域-VII中保守的DYG-Mg2+-结合基序内的Gly2019至 丝氨酸残基的氨基酸置换[3]。近期的报告提示，该突变适中地增加了LRRK2的自 磷酸化以及其磷酸化髓磷脂碱性蛋白的能力～2-3倍[12，13]。这些发现提示，LRRK2 的过度活化使人类易发生PD，这意味着抑制LRRK2的药物可以用于延缓某些形 式PD的发生或甚至治疗某些形式的PD。难以表达活性重组酶和缺少有力的定量 分析阻碍了LRRK2的研究。

在本说明书中对在前公开的文件的列出或讨论不应必然地被认为是承认该文 献是本领域的一部分或是公知常识。

我们已经研制了表达活性重组LRRK2的方法，并且将其用于激酶底物示踪和 阐明(KinasE Substrate TRacking and ELucidation(KESTREL))筛选，所述筛选是 近期开发出来的，用于帮助寻找蛋白激酶的生理性底物(在[14]中有综述)。这导 致将膜突蛋白鉴定为潜在的生理性底物，其在被变性时在Thr558上被LRRK2有 效地磷酸化，所述Thr558是以前鉴定的生理性相关磷酸化位点。我们已经应用这 些发现开发LRRK2有力的和定量的分析(assay)。通过使用该方法，我们证明在 PD患者中鉴定的几个LRRK2突变，或者不影响或者实际上抑制而不是活化 LRRK2。