[发明专利]样品中不溶的分析物的测量

说明书

本申请要求2007年3月30日提交的美国临时申请60/920,814和2008年1月3日提交的美国临时申请61/018,717的申请日的权益。

发明背景

多个分子探针排列在表面或者“芯片”上已经用于多项生物学和化学测定中。进行测定以确定感兴趣的靶分子是否与任意探针相互作用。在选择的条件下探针暴露于靶分子之后，检测装置确定靶分子是否与指定探针相互作用。

这些系统可用于多项筛选方法中，以获得关于探针或者靶分子的信息。例如，它们可用于筛选结合感兴趣的受体的肽或潜在药物，以筛选含有不溶分析物的样品中例如遗传突变、等位基因变体或者特定病原体或者病原体株系的存在；研究基因表达，例如鉴别其表达与特定生理学状况、发育阶段或者疾病状态等相关的mRNA。

发明描述

从固定组织中精确测量基因、特别是基因表达或者寡核苷酸具有许多益处。在临床样品情况中，所述方法可以靶向被测量的寡核苷酸，而不必需要改变临床实践-直接从固定的组织测量而不必制备冷冻样品。有大量储存的可用于回顾性研究的建档的固定材料，以用于鉴别和确认生物标记和靶基因，或者用于开发和确认监测、预测或诊断测定，或者用于与基因表达的安全性关联，或者用于了解疾病进程等。然而，从固定组织中进行这种测量存在问题。通过PCR或杂交方法测量需要大量组织和复杂提取以及样品制备方法。此外，通常观测到测量质量随着组织储存的时间延长而降低。相反，可以对新鲜固定的组织或者建档的组织进行原位测量(在组织内标记和观测RNA)，并产生相似质量的数据。本文描述的是从固定组织中测量寡核苷酸的方法，包括从组织中恢复探针，其中是所述探针而不是天然寡核苷酸自身作为测量基础。本发明进一步描述了使用核酸酶保护作用作为从固定组织中测量寡核苷酸的方法。如PCR等方法要求溶解、提取和纯化靶RNA，然后逆转录并且对所得cDNA进行扩增。bDNA需要溶解靶RNA。因此，需要逆转交联或者仅一部分RNA可以作为可溶RNA而恢复以用于通过这些方法测量。

本发明揭示的方法使得可以测量交联的寡核苷酸以及可溶的寡核苷酸。

得自临床或动物实验的组织切片通常被以适于后续显微镜检测的形式固定、包埋和储存。传统的固定方法通常应用醛固定剂，其通过在组织蛋白质内和之间产生交联反应而固定组织。交联趋于保护组织形态和完整性，使组织变硬以进行切片，并且抑制微生物攻击。在组织样品固定后，将其典型包埋于包埋介质中，以便样品可以被切成薄片。石蜡是最常用的包埋介质，但是也可以使用丙烯酰胺和火棉胶。

本领域也已知其它非福尔马林固定方法，如乙醇或醛固定方法。醛固定方法趋于导致组织样品结构明显改变。这些改变通常趋于导致也许存在于组织样品中的靶丧失其与靶向该抗原的抗体的反应性。福尔马林固定法明显锁住组织样品中蛋白质分子的三维结构。由于近来新的组织化学试剂的开发，现在可以进行在许多组织最初储存时不可能进行的组织化学分析。因此，已经开发了许多方法可以逆转由于醛固定法产生的一些改变，以及增强组织样品的组织化学染色性质。

一种常规的用于改善已经在福尔马林中固定以及在丙烯酰胺凝胶中包埋的组织样品的染色能力的实验室方法涉及将丙烯酰胺凝胶包埋的组织在1.0％2-巯基乙醇中处理15分钟，随后用磷酸盐缓冲盐水漂洗。恢复组织样品的组织化学染色性质的方法在Key等的美国专利No.5,244,787中描述。另一恢复组织样品的组织化学染色性质的方法在Shi等的美国专利No.5,578,452中描述。

固定的或者保存的样品中生物学靶的测量是具有挑战性的技术。已知在这个过程中蛋白质变性通常失去抗原性(即抗体识别能力)。碳水化合物可以被化学改变，特别是糖蛋白部分中与肽和蛋白质相关的那些碳水化合物。在细胞环境中核酸可以彼此之间交联以及与其它分子包括蛋白质、脂质和碳水化合物交联。这些分子的恢复和分析是昂贵且费时的过程。

由于多种原因导致固定组织中核酸的研究特别困难。福尔马林固定石蜡包埋的样品中的添加层或包膜对于常规探针和试剂是相当大的难题。此外，由于大多数探针依赖于直接附着以进行检测，因此靶中的二级和/或三级结构中的修饰存在难以识别和检测结构的难题。另一方面是识别的特异性，其可能由于在固定期间非天然暴露于化学制品及其它因素而丧失。