[发明专利]在真核生物中精确替换靶DNA的方法和手段

权利要求书

1.在真核细胞或真核生物的基因组中将靶DNA序列交换为目的DNA 序列的方法，其包括如下步骤：

a.在所述真核生物细胞基因组中的预选位点诱导第一双链DNA断 裂，所述预选位点位于所述靶DNA序列内部，且所述预选位点被第一双 链断裂诱导酶，DSBI酶识别；

b.向所述真核细胞中引入修复DNA分子，所述修复DNA分子包含：

i.位于两侧翼DNA区域之间的所述目的DNA序列，所述侧翼 DNA区域与侧接所述靶DNA序列的DNA区域，与侧接所述真核 细胞基因组中所述预选位点的DNA区域具有至少80％的序列同源 性；

ii.位于所述侧翼DNA区域之间的可选择或可筛选标记基因， 所述可选择或可筛选标记基因位于由所述预选位点5’端部分组成的 第一重复序列和由所述预选位点3’端部分组成的第二序列之间，其 中所述第一和第二重复序列之间共同的序列是同向重复；和

iii.位于所述一个侧翼DNA区域与所述第一第二重复序列之间 的第二DSBI酶的至少一个识别位点；

c.选择含有所述可选择或可筛选标记的细胞群；

d.选择已经通过所述侧翼DNA区域的同源重组引入了所述可选择或 可筛选标记的细胞；

e.在所述细胞中所述第二DSBI酶的识别位点处引入双链断裂；和

f.选择通过所述同向重复之间的同源重组缺失了所述可选择或可筛 选标记基因，由此重建了所述预选位点的子代细胞。

2.权利要求1的方法，其中通过引入第一DSBI酶来诱导所述预选位 点处的所述第一双链断裂，所述第一DSBI酶不识别位于所述修复DNA中 的所述第二DSBI诱导酶的所述识别位点。

3.权利要求1的方法，其中所述第一DSBI酶和所述第二DSBI酶是 选自以下的两种不同的DSBI酶：I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I或PI-Tsp I，或包含锌指DNA结合结构域和DNA 切割结构域的嵌合内切核酸酶，或定制的兆碱基大范围核酸酶。

4.权利要求1的方法，其中所述第一DSBI酶是识别所述预选位点的 定制的兆碱基大范围核酸酶。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述第二DSBI酶是I-SceI。

6.权利要求5的方法，其中所述第二DSBI酶是核苷酸序列SEQ ID  No 1或SEQ ID No 2编码的酶。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述真核细胞是植物细胞， 或者所述真核生物是植物。