[发明专利]在真核生物中精确替换靶DNA的方法和手段

说明书

技术领域

本发明涉及在真核细胞和真核生物(如植物细胞和植物)中通过同源重组将靶DNA序列精确交换为目的DNA序列的改进的方法和手段，其中能够随后去除可选择或可筛选标记，而不引入任何其他序列变异，该可选择或可筛选标记在同源重组阶段为临时选择基因替换事件而使用。 

背景技术

同源重组允许在原核生物及选择的真核生物中进行众多靶向遗传修饰，包括选择的缺失、插入或替换。 

在高等真核生物中，可通过借助于罕见切割内切核酸酶(rare-cuttingendonuclease)如I-SceI诱导双链DNA断裂来促进同源重组。 

WO2004/067753描述了兆碱基大范围核酸酶在脊椎动物体细胞组织中诱导离体和整体同源重组的用途，及其用于基因组工程和基因治疗的应用。 

WO2000/46386描述了通过I-SceI诱导的双链断裂在细胞中修饰、修复、弱化和失活基因或其他染色体DNA的方法。还公开了对需要的个体治疗或预防遗传疾病的方法。 

已证明在植物中，利用I-SceI诱导双链DNA断裂使利用农杆菌向植物细胞中递送修复DNA的同源重组频率增加至少两个数量级(Puchta等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，93，5055-5060页)。Chilton和Que(2003，Plant Physiol.133：956-965页)和Tzifira等人(2003，Plant Physiol.133：1011-1023页)报道T-DNA优先整合由罕见切割酶I-SceI或I-CeuI人工诱导的双链DNA断裂。所述报道还包括含有相应罕见切割酶识别位点的供体T-DNA载体。 

另外，允许设计罕见切割内切核酸酶以改变该酶的底物或序列特异性的方法已有描述，从而允许在几乎任何目的基因座诱导双链断裂，而不依赖于任何天然罕见切割内切核酸酶识别位点的存在。简言之，可利用设计用以识别特异性核苷酸序列的锌指结构域与来自天然限制酶如FokI的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体来制备嵌合限制酶。此类方法已经在例如WO 03/080809、WO94/18313或WO95/09233以及Isalan等人，2001，Nature Biotechnology 19，656-660；Liu等人1997，Proc.Natl.Acad.Sci.美国94，5525-5530)中描述。另一种通过在变体文库中选择而产生定制的兆碱基大范围核酸酶的方法在WO2004/067736中描述。定制的具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的兆碱基大范围核酸酶也可以通过如WO2007/047859所述的理性设计而获得。 

WO2007/049095描述了在两个分开的、分别结合修饰的DNA靶半位点不同部分的亚结构域中具有突变的“LADGLIDADG”寻靶内切核酸酶变体，从而该内切核酸酶变体能够切割包含各亚结构域所结合的核苷酸的嵌合DNA靶序列。 

WO2007/049156和WO 2007/093836描述了具有新的切割特异性的I-CreI寻靶内切核酸酶变体及其用途。 

WO2007/047859描述了理性设计的、具有改变的序列特异性和DNA结合亲和力的兆碱基大范围核酸酶。 

WO2006/105946描述了在植物细胞和植物中通过同源重组将靶DNA序列精确交换为目的DNA序列的方法，其中能够在随后去除在同源重组阶段为临时选择基因替换事件所使用的可选择或可筛选标记而不留足迹，且在去除步骤中也无需采取体外培养，其中所述的方法采用通过小孢子特异性表达诱导双链断裂的罕见切割内切核酸酶而去除选择的DNA。 

美国临时专利申请60/828,042和欧洲专利申请06020370.0以及WO2008/037436描述了WO2006/105946中的方法和手段的变通方式，其中由诱导双链断裂的罕见切割内切核酸酶所诱导的选择DNA片段的去除步骤处于种系特异性启动子的控制之下。该方法的其他实施方案有赖于修 复DNA一端的非同源性末端联接以及另一端的同源重组。