[发明专利]用于生产琥珀酸的微生物

说明书

技术领域

本发明涉及包含基因SDH2和/或DIC1的至少一种以及基因IDH1的微生物，涉及这样的微生物的应用以及涉及用于其生产的方法。

背景技术

二羧酸具有高度的经济潜力，因为它们可以被用作许多化学制品的前体物质。例如，琥珀酸用作用于基于1，4-丁二醇、四氢呋喃和γ-丁内酯的塑料生产的初始阶段。今天，琥珀酸通过马来酸酐催化水合为琥珀酸酐并随后水加成或通过马来酸的直接催化水合而化学生产。

琥珀酸也通过许多微生物在生理环境条件下从糖或氨基酸形成。在厌氧条件下，除了琥珀酸外，通常形成进一步发酵终产物如乙醇、乳酸、乙酸和蚁酸，。具有其高氧含量的琥珀酸的生物合成需要CO₂的还原固定(reduktive CO₂-Fixierung)。

琥珀酸是代谢物，其通常通过厌氧发酵过程富集。而厌氧条件下所述产物的产率和富集是需氧条件下的几倍，完全厌氧过程的缺点是生物量(biomassen)生产的技术限制和微生物生产者的低生产力。因此，结果是较低的生物量/产物效率。此外，难以严格地技术处理厌氧微生物。

能够在厌氧条件下合成琥珀酸的多种微生物在本领域是已知的。文件US 5,143,834描述了产琥珀酸厌氧螺菌(A.succiniciproducens)的变异体。这是专性的厌氧微生物，其仅可以产生中等量的琥珀酸，此外不能耐受高渗透压和盐浓度。文件US 7,063,968描述了微生物瘤胃分离物，曼海姆菌(Mannheimia sp.)55E，其能够在需氧和厌氧条件下合成有机酸。然而，这不是琥珀酸的特异性富集，而是不同有机酸的混合物，如蚁酸、乙酸、乳酸、和琥珀酸。这种生产者的缺点是所述菌株的经济应用即使不是不可能，也仅仅是很难实现的，因为为了获得琥珀酸，不得不采用昂贵的富集和纯化方法。文件US 5,869,301描述了用于在两步发酵过程中利用大肠杆菌(E.coli)AFP-111生产二羧酸的方法，其中在第一阶段微生物的生物量在需氧条件下产生，在第二阶段，琥珀酸的生产以厌氧方式进行。生物量产生的第一阶段被限制在这个过程中，因为，在分批供料过程中葡萄糖浓度必须被限制为1g/L，以便避免扰乱生物量生产过程和琥珀酸生产的乙酸盐的富集。因此，通过这个过程的产生生物量的可能性非常小。此外，在这个过程中琥珀酸的生物合成途径受到强烈的代谢物阻遏，因为糖酵解、柠檬酸循环和乙醛酸途径的基因被葡萄糖强烈地阻遏，这可以从文件DeRisi J.L.，Iyer V.R.，Brown P.O.，Science 278(5338)：680-686(1997)获知。结果是在存在葡萄糖时琥珀酸的合成被很大程度地阻遏并由此受到强烈受限。

根据文件US 6,190,914的微生物是本领域已知的，其中通过合适的转录因子和激酶的调变(modulation)，多种基因的葡萄糖阻遏被减少。但在其中无法获取通过这样的微生物生产有机酸，特别是以及进一步获取用于生产针对有机酸而被优化的微生物。

发明目的

因此本发明的技术目的是详细说明一种方法和用于实施后者的微生物，其允许在发酵过程中没有限制地生产生物量，产生乙醛酸循环的羧酸，尤其是琥珀酸，而在生产过程中没有生物合成途径中的代谢物阻遏，以及确保在所述生产阶段期间尽可能低的副产品富集。

发明基础和优选的实施方式

为了实现这个技术目的，本发明教导了分离的遗传修饰的微生物，其中基因DIC1和SDH2的至少一种或二者以及基因IDH1在第一外源启动子的控制下，所述第一外源启动子通过培养添加剂被阻遏于生长培养基，在缺乏所述培养添加剂时所述启动子是有活性的，以及这样的微生物在用于产生乙醛酸循环的羧酸(尤其是二羧酸，例如琥珀酸)的方法中的应用，所述方法包括下面的步骤：a)所述微生物在生长培养基中被培养并繁殖；b)随后所述微生物被转移入生产培养基，所述生产培养基包含阻遏所述第一启动子的培养添加剂，或者阻遏所述第一启动子的培养添加剂被加入到所述生长培养基并被培养(如果在需氧或厌氧条件下适用)；以及c)在步骤b)后或步骤b)期间，从培养物上清液分离羧酸并任选地被纯化。