[发明专利]用于病毒纯化用连续超速离心的糖溶液配方

说明书

本申请要求申请日为2007年5月4日的美国临时专利申请No.60/927,692的优先权， 现将其全部内容并入本文作为参考。

技术领域

[0001]本发明涉及病毒纯化领域。

背景技术

[0002]病毒，无论是自然出现的还是其重组体，皆可用于疫苗接种和基因治疗领域。 许多病毒或类病毒粒子可以安全并有效地在寄主细胞中增殖。有数种公开出版物描述了从 寄主细胞中提纯病毒的技术，主要集中于特异性的层析基质的应用，用于由寄主细胞裂解 物纯化病毒(参见，例如，美国专利No.6,008,036)。描述的其他方法，例如，在美国专 利No.6,048,537中描述的方法使用了连续式蔗糖梯度离心，其提供的产品具有较小的抗原 纯度，并且要求进一步通过离心提纯的步骤。这些方法也还遭受抗原聚集之患，这可以导 致病毒抗原的损失，或者抑制病毒失活步骤。

[0003]病毒聚集还可能会抑制层析工艺的产率，其时间和成本要求高，难以适合于 大规模生产。因此，本发明的目标在于提供一种纯化病毒、尤其是从寄主细胞样本中纯化 病毒的方法，其比较简单，但仍能以高纯度提供全病毒抗原组分，同时减少病毒抗原聚集。

附图说明

[0004]图1：用普通的超速离心工艺(图1a)和本发明的超速离心工艺(图1b)纯 化的PMVHs的显微照片。

发明内容

[0005]本发明提供一种用于提纯病毒或病毒抗原的方法，其包括：提供病毒制品并 在糖梯度中离心所述病毒制品，其中该糖梯度是由在缓冲水溶液中的浓度为蔗糖当量34％ 至50％(w/w％)的第一糖层A和浓度为蔗糖当量50％至65％(w/w％)的第二糖层B 所建立的，缓冲水溶液中的一种缓冲剂成分是pKa值为6.0～9.4的缓冲剂成分；以及从离 心液中收集所述病毒或病毒抗原，即，离心方法的产物。

[0006]本发明的一个方面在于提供一种提纯病毒或病毒抗原的方法。该方法涉及到 提供包含糖梯度的溶液，所述糖梯度是通过离心至少一种第一缓冲糖溶液和至少一种第二 缓冲糖溶液而建立的。在第一缓冲糖溶液中的糖浓度具有35％至50％(w/w％)的蔗糖当 量；在特定的实施方式中，蔗糖当量为34％至46％(w/w％)。在第二缓冲糖溶液中的糖 浓度具有50％至65％(w/w％)的蔗糖当量；在特定的实施方式中，蔗糖当量为50％至 60％(w/w％)。一旦建立起糖梯度，就将病毒制品加至该糖梯度。然后将病毒制品和糖 梯度离心以得到波峰汇集液(peak pool)，并且萃取波峰汇集液以得到病毒或病毒抗原。

具体实施方式

[0007]在病毒或病毒抗原提纯期间，通过离心浓缩病毒或病毒抗原，从而使其与细 胞培养基成分和/或寄主细胞和寄主细胞成分相分离。本发明的方法能够在提纯的离心步骤 中使病毒聚集和病毒损失最小化。

[0008]在本发明的方法中，通常将生理学缓冲液中的第一糖溶液垂直地加载入连续 超速离心装置，从而形成水平的糖溶液层A；然后将在相同或不同的生理学缓冲液中的更 高浓度的第二糖溶液加载入该装置，从而形成水平的糖溶液层B。然后启动该装置，形成 糖梯度。最大浓度在装置的外壁，并且浓度朝向装置的中心逐渐变小。然后将来自细胞培 养物的包含病毒的收获液加载入装置中，并且病毒颗粒会迁移到糖梯度中的位置，在该位 置它们的密度与梯度密度相等。当糖是蔗糖时，出现该平衡的典型密度范围是36％-48％ (w/w％)蔗糖。一旦装置停止，该梯度会向水平位置移动，并且该包含病毒颗粒的梯度 部分(或者“波峰汇集液)”将从装置中被抽出。

[0009]本发明的一个方面是一个令人惊奇的发现，与惯常的利用单一浓度蔗糖水溶 液从而形成蔗糖梯度的方法相比，其通过利用双层溶液的方法，能够增加波峰汇集液的体 积。即使使用蔗糖、并且梯度中的最大蔗糖浓度与在常规方法中使用的相同，也能得到这 一令人惊奇的效果。通过优化两个蔗糖溶液层A和B的浓度和含量，能够增加波峰汇集液 体积，例如，增加两倍。通过减小全病毒颗粒或抗原各自的浓度，该增加的波峰汇集液体 积可减少它们的聚集。