[发明专利]具有改变的电子传递途径的修饰珠蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及修饰的载氧化合物(氧载化合物，oxygen-carryingcompound)例如血红蛋白及它们的应用。

背景技术

用捐献的血对患者输血具有许多缺点。首先，可能缺少患者的血型。第二，存在捐献的血可能被诸如肝炎病毒和HIV这样的传染原(病原体，infectious agent)污染的危险。第三，捐献的血保存期限有限。另外，存在一些其中血液可能不容易获得的情形，例如战场上或国内紧急事件的情形。

输血的一种替代方案涉及使用血液代用品。血液代用品是一种也可提供对于保持血容量必要的渗透压的载氧溶液。最近研究了两种类型的代用品，即氟碳代血液(氟碳乳剂，fluorocarbon emulsion)和血红蛋白溶液。

存在于红细胞中的血红蛋白由两条α珠蛋白链和两条β珠蛋白链构成，它们各自载有一个血红素分子。一条α样珠蛋白链和一条β样珠蛋白链结合而形成非常稳定的二聚体(dimer)。α样和β样珠蛋白基因属于相关珠蛋白基因家族，其在不同发育阶段被表达并受氧张力、pH和从胚胎到胎儿到新生儿的发育所调控。然后两个二聚体以反平行方式排列而形成四聚体。二聚体结合而形成四聚体不如单体结合而缔合成二聚体那么强。因此，四聚体具有分解而形成二聚体的趋势且在四聚体、二聚体和单体之间总是存在一个平衡。在高浓度珠蛋白下，主要形式是四聚体；通过稀释，二聚体变成主要形式。由于结合力部分是静电的，所以这种平衡也受溶剂、盐、pH和其它因素影响。

然而，使用天然的血红蛋白作为血液代用品存在阻碍。首先，需要大剂量，需要大量生产蛋白，其通过重组方式或者来自捐献的人血液或回收的非人血液。第二，获得无传染原和有毒物质的血红蛋白很重要。第三，尽管血红蛋白通常是68,000分子量的四聚体，但它可以分解而形成α-β二聚体。该二聚体被肾快速清除，并且对于无细胞血红蛋白来说停留时间太短而不能用作血液代用品。

已经采取几种方法以克服这些困难。这些方法包括通过重组DNA系统表达血红蛋白、化学修饰血红蛋白、以及生产血红蛋白变体。血红蛋白及其变体在包括大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞如CHO细胞的各种细胞体系中被表达。

已知血红蛋白的许多天然变体。这些变体包括：自动聚合的变体、阻止四聚体分解的变体、以及在碱中稳定的变体。还有超过30种具有降低的氧亲和性的天然血红蛋白变体。这样的变体的若干实例在WO88/091799中披露。

改善血红蛋白使用的另一种方法是通过加入其他聚合物而修饰该蛋白，从而改善血液中该蛋白的稳定性。例如US 5,900,402描述了使用非抗原性聚合物，优选聚环氧烷(聚氧化烯烃或聚烷撑氧，polyalkylene oxide)或聚乙二醇。

因为血红蛋白(和实际上的肌红蛋白或其它载氧蛋白)涉及氧的运输和储存，由于具有这种功能(因为蛋白的卟啉环中存在的铁离子的氧化还原性质)，它们负责生成反应活性氧物种。含氧衍生物(Fe(II))的自动氧化导致生成非功能性的三价铁血红素(ferrichaem)(Fe(III))和超氧化物离子(O₂^-)，其随后歧化而生成H₂O₂。这些物种最终能够损害蛋白和/或血红素基团。在导致这种破坏的途径中的一个重要中间体是四价铁血红素(ferry haem)(Fe(IV)＝O^2-)本身，其是通过血红素与H₂O₂和脂过氧化物的反应形成的。蛋白/卟啉基自由基阳离子(P^+·)伴随从三价铁血红素和过氧化氢生成四价铁血红素，如化学方程式(1)中列出的：

P-Fe(III)+H₂O₂→P^·+Fe(IV)＝O^2-+H₂O    (1)

尽管它们短暂存在，但是四价铁血红素和自由基也可能是有极大毒性的。这些氧化级联可能是损害性的，因为：(i)过氧化氢是一种已知产生细胞损伤的强氧化剂，(ii)四价铁血红素和蛋白质基自由基都可以通过夺取氢原子而引发脂质、核酸和氨基酸的氧化，以及(iii)血红素修饰可以导致产生对蛋白交联物种的高毒性血红素以及导致血红素损失和“游离”铁的释放。