[发明专利]检测和分离生物流体样品中血清γ-谷氨酰转移酶(GGT)同种型的方法和由此获得的酶同种型

权利要求书

1.一种检测生物流体样品中的血清γ-谷氨酰转移酶(sGGT)同种型的方法，其包括下述步骤：

(a)借助于适合基于分子量分离血清蛋白的HPLC柱，通过高效液相色谱(HPLC)分离存在于所述样品中的血清蛋白，以实现将血清蛋白分离成不同的馏分并且随后将分别与每一馏分结合的不同血清γ-谷氨酰转移酶(sGGT)同种型分离；

(b)使在前面步骤中获得的每一蛋白质馏分与γ-谷氨酰转移酶(sGGT)底物进行柱后反应，所述γ-谷氨酰转移酶底物能够在这样的蛋白质馏分中在GGT的存在下形成可检测的产物；

(c)测定在每一蛋白质馏分中可检测产物的存在或不存在，在给定蛋白质馏分中可检测产物的存在表示在所述蛋白质馏分中结合的GGT同种型的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤用凝胶过滤HPLC柱进行。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(b)的反应中在GGT的存在下形成的所述可检测产物是发色团或荧光化合物。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述步骤(b)的反应在γ-谷氨酰基团的受体的存在下进行。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述γ-谷氨酰基团的受体是甘氨酰甘氨酸。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中能够在GGT的存在下形成可检测产物的所述GGT底物选自γ-谷氨酰基-7-酰氨基-4-甲基香豆素、γ-谷氨酰基-4-甲氧基-萘酰胺、γ-谷氨酰基-4-硝基酰苯胺、γ-谷氨酰基-3-羧基-4-硝基酰苯胺、γ-谷氨酰基-3，5-二溴-4-羟基-酰苯胺。

7.根据权利要求6所述的方法，其中能够在GGT的存在下形成可检测产物的所述GGT底物是γ-谷氨酰基-7-酰氨基-4-甲基香豆素并且所述可检测产物是7-氨基-4-甲基香豆素。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述测定步骤(c)包括测定每一蛋白质馏分中GGT的存在和定量GGT活性。

9.根据权利要求8所述的方法，包括下述步骤：

(a)借助于适合基于分子量(或分子大小)分离血清蛋白的HPLC柱，通过高效液相色谱(HPLC)分离存在于所述样品中的血清蛋白，以实现将血清蛋白分离成不同的馏分并且随后将分别与每一馏分结合的不同血清γ-谷氨酰转移酶(sGGT)同种型分离；

(b)使在前面步骤中获得的每一蛋白质馏分与底物γ-谷氨酰基-7-酰氨基-4-甲基香豆素进行柱后反应，所述底物能够在这样的蛋白质馏分中在GGT的存在下形成荧光产物7-氨基-4-甲基香豆素；

(c)应用380nm的激发波长和440nm的发射波长，通过荧光测定，测定并定量每一蛋白质馏分中的所述产物7-酰氨基-4-甲基香豆素。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述生物流体选自血浆、血清、尿、细胞培养物和细菌培养物上清。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，进一步包括步骤(d)：分离步骤(c)中测定的所述血清γ-谷氨酰转移酶(sGGT)同种型。

12.酶同种型，其具有γ-谷氨酰转移酶(GGT)活性并具有大约2000KDa的分子量。

13.酶同种型，其具有γ-谷氨酰转移酶(GGT)活性并具有大约940KDa的分子量。

14.酶同种型，其具有γ-谷氨酰转移酶(GGT)活性并具有大约140KDa的分子量。

15.根据权利要求12至14的任一项所述的酶同种型，其可由根据权利要求11所述的方法获得。