[发明专利]检测和分离生物流体样品中血清γ-谷氨酰转移酶(GGT)同种型的方法和由此获得的酶同种型

说明书

本发明涉及检测和分离血清γ-谷氨酰转移酶(GGT)同种型(isoform，同工酶)(sGGT)——其存在于生物流体如，例如血清或血浆的样品中——的方法以及通过本发明的方法获得的酶同种型。

γ-谷氨酰转移酶(EC2.3.2.2，也称为γ-谷氨酰转肽酶)是在血液(5)、大多数生物流体中以及大多数细胞类型的质膜上发现的酶。一些组织，如肾皮质、脑脉络丛、胆管结构(bile structure)、泌乳乳腺尤其富含GGT(6)。大多数实体瘤(7)以及T-白血病细胞——髓系和淋巴细胞(8)——也特别富含GGT。

GGT是唯一的能够催化谷胱甘肽(GSH)——哺乳动物细胞中最重要的抗氧化剂——水解的酶(9)。GGT位于细胞膜的外表面上的事实暗示其底物将主要是细胞外的GSH，并且本发明人获得的实验结果已经为此提供了证据。虽然谷胱甘肽水解在肾脏肾小管细胞和其他通常含GGT的组织中回收GSH中具有生理功能，但是其在病理组织中通过产生活性氧种类、自由基和激发氧化事件而对细胞结构具有有害结果(10)。而且，在肿瘤细胞中，高GGT活性的表达使得它们通过GSH的细胞外水解产物——其能够与药物反应并钝化药物——的特别反应性而对抗肿瘤的化疗剂产生抵抗。

迄今为止，GGT——其存在于血液循环中，称为血清GGT(sGGT)——的生理功能还没有得到很好的阐明，但是已知sGGT活性根据年龄、性别、生理状况而不同，并且是这样的病理状况如肝胆病理状况和酒精中毒的后果。由于这个原因，sGGT活性分析一般作为临床化学中的测试应用，这是由于sGGT水平被认为是肝胆病理状况和饮酒的标记物。

在许多患者中检测到高(病理的)sGGT值，但是只在非常低百分比的病例中实际上诊断为肾病或确认为酒精滥用。许多患者经受长时间的昂贵的诊断程序(如，例如，实验室检查、超声扫描、肾活检等)，而没有最终导致已有病状的任何诊断。

而且，近年来，不论肾病理的存在与否，sGGT作为发病率和早死率(premature mortality)的最强预测因子之一产生。在过去10年中出版的著作实际上已经表明到目前为止sGGT水平被认为是非病理性的，虽然取决于参考范围(sGGT 5-50U/L)的高侧(high side)(sGGT＞25U/L)，其与升高的心血管死亡率以及糖尿病的风险相关(1，2，3)。甚至更近期地，已经显示回收后测定的sGGT水平是许多病理中不利进程——不仅是心血管病理进程而且是肿瘤、变性以及其它病理进程(4)——的最强的指示。清楚的是，尽管通过使用单独的sGGT测定，其预测值的极宽范围使其不可能预测将会影响患者的病理——更不用说其结果，也不可能指导随后的诊断-治疗方法，但是这种强的死亡率和发病率指示可能在临床上非常有用。由于这个原因，血清GGT活性的测定被视为是灵敏且准确的实验室测试，但遗憾的是，不是特异的测试。

实际上，即使已知sGGT水平的决定因素，但是关于这种酶的来源、性质、功能以及后果却知之甚少。包括在正向决定因素内的是例如饮酒、用药——包括口服避孕药——年龄、疾病如糖尿病、高动脉压和高胆固醇血症，而包括在负向决定因素内的是锻炼、喝咖啡和肺换气量(1)。

许多研究已经涉及不同GGT同工酶的研究(12)，试图建立与具体的病理学和/或不同来源组织的关联。

实际上，由于已经在人类中鉴别出能够编码活性GGT的单个基因(13)，所以使用术语“同工酶”来指不同的可检测的GGT形式是不完全正确的；相反，使用一般术语“同种型”似乎更正确。

很长时间已知，通过应用各种方法，可能将来源于不同组织的GGT以及不同形式的血清GGT 区别开，因为有可能在疾病的进程中显示不同GGT形式的出现，或至少展示不同GGT形式的模式变化。

为了检测和分离GGT同种型，已经应用不同的技术，但是却产生两个重要的问题。第一个问题包括测定的低灵敏度，而第二个问题由极度的蛋白质亲脂性引起的，这在许多情况下使以实现末端亲脂部分脱离从而允许在液体体系中分析蛋白质为目的的GGT的蛋白水解消化变成必要。

通过应用凝胶过滤、琼脂糖凝胶电泳、等电聚焦、凝集素亲和或阴离子交换层析技术(其是考虑酶的蛋白水解消化并且不能在组织提取物和血浆上进行的程序)，已经可能证明不同的组织产生相同的酶蛋白质但是具有不同的糖基化并且因此具有不同的表面静电电荷(14)。