[发明专利]半连续和连续酶促水解方法

说明书

本发明涉及受保护的醇基团，例如酯或氨基酸酯或磷酸酯基团的区域选择 性酶促水解的改进方法。

WO05/121162描述了通过在受保护的醇基团的核糖部分的5’-基团进行选 择性水解而制备的某些D-呋喃核糖基化合物。然而，WO05/121162描述的酶 促水解方法本身对非均相反应方法固有例如反应时间长、水解的选择性有限、 每批需要大容器、数个过滤步骤和不易于回收酶等缺点。

本发明提供区域选择性酶促水解的改进方法，该方法克服了以前采用的区 域选择性酶促水解方法的许多缺点。根据本发明，出乎意料地发现通过对具有 一个以上可水解基团的底物进行区域选择性酶促水解的半连续或连续式方法， 可实现较高的水解选择性和较少的杂质以及不良水解产物。此外，相对于以前 采用的长时间、高成本、低处理量的间歇式方法，这种半连续或连续方法是长 期而经济的解决之道。与例如WO05/121162描述的方法相比，本发明方法可 显著缩短周期时间并尽可能降低对总容量性能低的影响。这与处理量增加的大 规模方法尤其相关。

因此，就其最宽的方面而言，本发明提供一种区域选择性酶促水解包含一 个以上可水解基团的底物的方法，其中所述酶促水解以半连续或连续方式进 行。

在本发明的半连续或连续式方法中，通常使加成物的缓冲溶液流过固定化 酶。本发明的术语“半连续”或“连续”指或多或少连续地(有间断或没有间 断)流过柱的过程。合适的停留时间后，加成物完全水解，该过程可原位监测， 例如通过对柱后收集并随后提取的包含产物的溶液的pH监测。半连续或连续 式方法的关键参数需要依据例如底物、酶等独立进行调整，具体情况可凭经验 确定。这些参数包括，例如停留时间、柱的填料、最佳pH、温度、加成物的 浓度、有机溶剂的选择。例如，可调整停留时间以使加成物达到最佳水解，即 选择性高并且转化快，所述停留时间通常可以是0.1分钟到300分钟。例如， 停留时间取决于酶活性、温度、pH、溶剂体系，可调整停留时间从而能允许半 连续或连续处理和最佳水解，如上所述。通常根据酶水解反应所需的条件选择 pH和温度。例如，pH可以介于，例如5-8，或者例如5.5-7.5之间。温度可以 在，例如15℃-70℃。

可利用适合于酶促反应的任何缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、铵缓冲液、碳 酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液。

此外，为完全溶解加成物和产物，可利用合适的有机组分。典型的有机组 分包括，例如丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮、甲醇、甲醇、乙醇、异丙醇、正 丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、叔丁基甲基醚、四氢 呋喃、2-甲基四氢呋喃、二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲 基亚砜、离子性液体、压缩气体，如二氧化碳、水等等，或它们的混合物。 也设想了其它醇类、醚类、酮类。

此外，可利用添加剂，例如来提高反应速率。典型的添加剂包括，例如 PEG(1％-10％)、NaCl、Na₂SO₄、FeCl₃。可凭经验确定这些添加剂的合适 浓度，通常可以是0.05M-1M。为方便起见，可将添加剂加入加成物的溶 液中。

将酶固定在物理支承物，例如固体支承物上。适合于本发明的固定化酶所 用的物理支承物包括，例如柱、连续搅拌罐、填充床反应器、膜式反应器、膜。 根据本发明可使用适合于水解的任何酶，例如酯酶、水解酶、脂肪酶。

本发明方法的合适底物含有至少两个可水解的基团，即，例如两个乙酸酯 基、苯甲酸酯基。这种基团的典型例子是保护的醇基团，例如酯基、氨基酸酯 基、磷酸酯基。在一个实施方式中，底物是吡喃糖苷或呋喃糖苷。

按照本发明的一方面，底物是通常由如以下式(1)-(21)所示的化合物(不具 有立体化学特性)：