[发明专利]用于非侵入性产前诊断的方法和装置

说明书

技术领域

本发明涉及用于非侵入性产前诊断，特别是用于识别胎儿中的基因和 染色体病症的方法。

现有技术

对于染色体病症的产前诊断是为了突出胎儿中的染色体异常的目的 而引入的。

迄今，胎儿受染色体病症影响的诊断确定仅能通过侵入性诊断测试而 获得，通过羊水穿刺、绒膜绒毛的采样或脐穿刺的方法检查胚胎细胞以确 定核型。

全部这些测试是侵入性的并且涉及增加的流产风险。因此，它们通 常被推荐用于超过35岁的女性，或在以前的怀孕中曾经怀有受染色体病 症影响的胎儿的妇女或当超声扫描确定具有畸形的胎儿时。

在母体循环中发现胎儿细胞的存在，虽然很少，但是已经引起许多小 组研究并且开发用于分离和回收所述细胞的方法，这容许非侵入性产前诊 断。具体地，存在三种能通过胎盘屏障的主要胎儿细胞类型：淋巴细胞， 营养细胞和成红血细胞。在这些中，研究已经首先针对研究用于分离来 自外周母体血液的胎儿成红血细胞和营养细胞，源自胎盘的上皮细胞的方 法。从外周血分离营养细胞受它们的多核形态的限制，然而已经证明 [8-13]，在妊娠的第6周和15周之间，经宫颈样品中存在这些细胞。应当 注意，从胎盘迁移的营养细胞经常粘合其它营养细胞或母体细胞，形成凝 块。

最近通过直接应用到非培养的胎儿细胞的分子生物学方法已经使得 胎儿细胞的鉴定成为可能。所述方法例如是产前FISH(荧光原位杂交)和定 量荧光-聚合酶链式反应(QF-PCR)。QF-PCR是能识别和同时量化染色体 特异性的DNA序列的方法，其可适用于单独的细胞，允许了基于非常低 数量胎儿细胞的遗传分析。在文献中，存在许多出版物，包括一些综述 [1-6，见说明书结尾的参考文献]，将其内容结合在这里，用于作为涉及 QF-PCR在产前分析中应用的所需部分的简单参考。

D.W.Bianchi和同事基于多参数评分开发了[14-27]从母体血液分离胎 儿具核红细胞(NRBCs)的系统；所述参数包括两种形态学特征(核的圆度和 形态)和胎儿血红蛋白标记的两种性质(细胞质的荧光强度和周围发光度)。 该流程提供根据密度梯度分离单核细胞和通过消除白细胞的富集(具有关 于CD15和CD45的抗体的MACS)和使用利用γ抗-血红蛋白抗体的FACS 方法在细胞荧光计上分离。在显微镜观察下，使用显微操作器回收通过多 参数评分鉴定的细胞。

评分系统是非常费力的，并且使用显微操作器引起部分细胞的损失。 通常，该方法已经在回收胎儿细胞方面显示74％的灵敏性，兼有5％的假 阳性频率。

由其它工作还已知[7]，根据密度梯度分离单核细胞和通过缺少CD71+ 细胞的MACS富集样品，其进一步由关于γ和ε胎儿血红蛋白链的特异性 抗体标记。然而，所述标记可以产生非特异性，因为在成人细胞中存在 产生胎儿血红蛋白的情况，或归因于胎儿血红蛋白和成人血红蛋白的抗体 之间的交联，这是由这些血红蛋白链的类似性所引起的。

MonaLiza医疗公司(美国专利2005/0181429A1)开发了使用经宫颈细 胞的产前遗传分析方法。所述方法基于Pap涂片细胞刷用于回收经宫颈 样品的用途，所述样品通过细胞离心处理以用于制备载玻片。标记经宫颈 细胞并且在显微镜下进行分析并且记录它们在载玻片上的位置和坐标。 在FISH中分析载玻片并且使用先前获得的坐标鉴定营养细胞。所述方法 的缺点是，在用于制备载玻片的处理期间，损失部分经宫颈细胞，其由于 营养细胞的缺乏而无响应(no-call)。

AVIVA-Biosciences公司(见，例如EP-A-1439897)开发了基于生物芯片 的富集系统，以用于从母体血液分离胎儿细胞。该方法使用容许除去大 部分红细胞的试剂，借助于高度特异性的磁珠和胎儿抗原的特异性抗体的 混合物(cocktail)的分类，和借助于具有根据待分离细胞类型的可变直径孔 的高分辨率过滤室的富集。

然而，所述方法被局限于通过样品富集选择胎儿细胞，这不限制具有 污染的母体细胞的可能性，和因此后续发生不可靠遗传分析的风险。

简言之，迄今没有一种以上提到的非侵入性方法证明其可以被用作诊 断胎儿非整倍性和/或其它染色体缺陷的常规实践。