[发明专利]在奶中产生外源蛋白的转基因哺乳动物

权利要求书

1.生产胰岛素的方法，包括：

a)制备在其奶中产生修饰的胰岛素前体的非人转基因哺乳动物；

b)从非人转基因哺乳动物获得奶；

c)从奶中纯化修饰的胰岛素前体，得到纯的修饰的胰岛素前体；

d)将纯的修饰的胰岛素前体转化成胰岛素；和

e)纯化胰岛素。

2.权利要求1的方法，其中非人转基因哺乳动物通过包括以下步骤的方法制得：

a)将编码修饰的胰岛素前体的核酸序列克隆至质粒中，由此将该序列可操作地连接到将指导该序列在乳房细胞中表达的启动子上，得到表达质粒；

b)用表达质粒转染体细胞，使得质粒掺入到体细胞的基因组中，得到转基因体细胞；

c)将成熟的卵母细胞去核，得到去核的卵母细胞；

d)将一个转基因体细胞与去核的卵母细胞融合，得到单细胞胚胎；

e)将胚胎植入受体哺乳动物的子宫中；和

f)监控怀孕直到转基因哺乳动物的出生。

3.权利要求2的方法，其中启动子是β酪蛋白启动子，并且其中修饰的胰岛素前体是修饰的哺乳动物胰岛素前体。

4.权利要求3的方法，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体、修饰的牛胰岛素前体、修饰的猪胰岛素前体、修饰的绵羊胰岛素前体、修饰的公山羊胰岛素前体或修饰的啮齿动物胰岛素前体。

5.权利要求4的方法，其中修饰的哺乳动物胰岛素前体是修饰的人胰岛素前体。

6.权利要求5的方法，其中表达质粒进一步包含新霉素抗性基因。

7.权利要求6的方法，其中表达质粒是p βmhuIP。

8.权利要求6的方法，其中表达质粒是pNJK IP。

9.权利要求6的方法，其中表达质粒是pβKLE IP。

10.权利要求2的方法，其中哺乳动物是在其奶中产生修饰的人胰岛素前体的牛，其基因组包含整合的质粒，其中该质粒包含编码修饰的人胰岛素前体的序列和指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。

11.权利要求10的方法，其中质粒进一步包含新霉素抗性基因。

12.权利要求11的方法，其中质粒是pβmhu IP。

13.权利要求11的方法，其中质粒是pNJK IP。

14.权利要求2的方法，其中哺乳动物是在其奶中产生融合蛋白的牛，该融合蛋白包含α乳清蛋白的片段、肠激酶切割位点和修饰的人胰岛素前体，该牛的基因组包含整合的质粒，其中该质粒包含编码融合蛋白的序列和指导该序列在哺乳动物的乳房细胞中表达的β酪蛋白启动子。

15.权利要求14的方法，其中质粒进一步包含新霉素抗性基因。

16.权利要求15的方法，其中质粒是pβKLE IP。

17.权利要求2的方法，其中体细胞是成纤维细胞。

18.权利要求2的方法，其中通过从用于在其奶中生产修饰的胰岛素前体的雌性转基因动物分离来获得转基因体细胞。

19.权利要求18的方法，其中转基因体细胞是成纤维细胞。

20.权利要求1、2或18的方法，其中哺乳动物属于牛物种、猪物种、绵羊物种、公山羊物种或啮齿动物物种。

21.权利要求20的方法，其中哺乳动物属于牛物种。

22.权利要求1、2或18的方法，其中胰岛素和修饰的胰岛素前体分别为哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体。

23.权利要求22的方法，其中哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体各自为人胰岛素和修饰的人胰岛素前体、牛胰岛素和修饰的牛胰岛素前体、猪胰岛素和修饰的猪胰岛素前体、绵羊胰岛素和修饰的绵羊胰岛素前体、公山羊胰岛素和修饰的公山羊胰岛素前体、或啮齿动物胰岛素和修饰的啮齿动物胰岛素前体。

24.权利要求23的方法，其中哺乳动物胰岛素和修饰的哺乳动物胰岛素前体各自为人胰岛素和修饰的人胰岛素前体。