[发明专利]在奶中产生外源蛋白的转基因哺乳动物

说明书

发明背景

在过去十年中已经由制药工业通过提取或通过重组技术来普遍地生产人保健中所涉及的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遗传构建体在细菌、酵母或哺乳动物细胞系中成功地得到了表达。然而，使用哺乳动物细胞培养物来获得复杂蛋白质，如需要适当糖基化模式的那些，涉及高成本的方法。

在过去十年间已经日益增长地使用重组DNA技术来生产商业上重要的生物材料。为此，已经克隆了编码各种医学上重要的人蛋白质的DNA序列。这些包括胰岛素、纤溶酶原激活剂、α1-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新兴的重组DNA技术，通常也从血液和组织中纯化这些蛋白质，这是昂贵而费时的方法，可能带有传播传感因子如导致AIDS和肝炎的那些的风险。

尽管在细菌中表达DNA序列来生产所需的医学上重要的蛋白质看起来是有吸引力的提议，但实际上细菌作为宿主常常证明是不能令人满意的，因为外源蛋白在细菌细胞中不稳定并且没有被正确地加工。

认识到这个问题，已经尝试了在哺乳动物组织培养物中表达所克隆的基因并已经在一些情况下证明了是可行的策略。然而，动物细胞的批量发酵是昂贵的且需要技术的过程。

因此存在对用于生产生物物质如正确修饰的真核多肽的高产率，低成本方法的需要。在这种方法中不存在对人具传染性的因子将是一个优势。

为了在奶中获得大量的人蛋白质，获得所需基因的转基因动物如牛的可能性已经引起了工业的极大兴趣。文献中的几个小组报道了他们生产人血清清蛋白、α抗胰蛋白酶的成功以及在转基因奶牛或山羊中的一些其它实例。

之前已经在小鼠或大鼠中进行了许多实验，将转基因表达限制于乳腺中往往是优选的，因为使用β酪蛋白或乳清蛋白启动子，其只响应哺乳期雌性中的乳腺转录因子。

专门在奶中表达异源蛋白意欲避免对宿主哺乳动物健康的不利影响并提供容易的纯化方法。

在细菌或细胞培养物中表达异源蛋白可能由于该重组蛋白对宿主哺乳动物的毒性作用而受到阻碍或阻止。在文献中可以找到许多实例，其中在特定的系统中不能表达某种蛋白，甚至是天然非毒性的蛋白，因为它对宿主是有害的，甚至引起宿主的死亡。死亡的原因可能是细胞内的高浓度蛋白，高浓度的分泌蛋白或与该蛋白的特异性相互作用和在外源宿主中引起细胞病变活性的一些细胞成分。

已经研发了几种方法来克服这些缺陷，以实现毒性蛋白的异源基因表达，包括使用融合蛋白，修饰原始蛋白序列，分开表达蛋白的不同多肽等。(参见，Protein Expression and Purification(蛋白表达和纯化)，2001年8月，22(3)：422-9)。

在转基因牛中表达重组蛋白时，可以产生相似的作用。在转基因哺乳动物的产生中，将细胞转染以获得携带目标外源基因的转基因克隆，然后将其用于产生转基因哺乳动物。该方法通常导致该目标序列插入到宿主基因组中，如果使用特异性的启动子，这是随后应当导致异源蛋白在靶组织或腺体中的事件，或如果使用通用启动子，将导致全身表达。蛋白表达的水平将取决于多种因素，包括基因组入发生的位置。

即使当通过组织特异性启动子指导基因表达时，使用几种蛋白，在许多不同哺乳动物物种中，已经观察到外源蛋白渗漏至外周循环系统中(参见Life Sciences，2006年1月25日；78(9)：1003-9，Epub2005年9月15日；和Journal of Biotechnology，2006年7月13日；124(2)：469-72，Epub 2006年5月23日)。根据表达的水平、渗漏的水平、异源蛋白的性质、物种(宿主和外源蛋白)之间的关系和异源蛋白与宿主受体相互作用的能力，这种渗漏可能具有相关的生物学后果。鉴于与宿主同源蛋白的相似性，这些通过转基因表达的蛋白中的一些可以对外源宿主发挥其天然的生物活性并可以引起能导致哺乳动物死亡的病理作用(参见，Endocrinology1997年7月；138(7)：2849-55)。此外，可能的是：异源蛋白不是通过与相应同源宿主受体的相互作用影响哺乳动物的健康，而是通过当一些异源蛋白在细菌中表达时发生的毒性、非特异性作用影响哺乳动物的健康。

本发明提供了通常与在转基因哺乳动物中表达对该哺乳动物具有毒性作用的蛋白相关的缺陷的创新性解决方法。

发明概述