[发明专利]PEG化的多肽的纯化

权利要求书

1.纯化单PEG化的红细胞生成素的方法，其包括以下步骤：提供包含单-、多-和未-PEG化的红细胞生成素的溶液，进行两个连续的阳离子交换色谱步骤，和回收在第二个阳离子交换色谱步骤中纯化的单PEG化的红细胞生成素，其特征在于，在两个阳离子交换色谱步骤中使用相同类型的阳离子交换材料。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述方法中，两个连续的阳离子交换色谱步骤是用不同的洗脱方法进行的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，两个连续的阳离子交换色谱步骤包括以下步骤：

a)在适于所述单PEG化的红细胞生成素与第一阳离子交换色谱柱中所含有的阳离子交换材料结合的条件下，将包含单-、多-、未-PEG化的红细胞生成素以及低分子量形式的混合物的缓冲水溶液加样在所述第一柱上，

b)利用穿流缓冲液的离子强度步进增加的分步洗脱方法从第一阳离子交换色谱柱上回收单PEG化的红细胞生成素，其中与加样的混合物相比，所述单PEG化的红细胞生成素在回收溶液中的分数增加，

c)在适于所述单PEG化的红细胞生成素与第二阳离子交换色谱柱中 所含有的阳离子交换材料结合的条件下，将步骤b)中回收的单PEG化的红细胞生成素加样在所述第二柱上，其中所述第二柱中所含有的阳离子交换材料与第一柱中的阳离子交换材料是相同类型的，

d)利用穿流缓冲液的离子强度连续增加的连续洗脱方法从所述第二阳离子交换色谱柱上回收基本同质的形式的纯化的单PEG化的红细胞生成素。

4.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述阳离子交换材料是磺丙基阳离子交换材料。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的该方法的步骤b)中的离子强度的步进增加是三步离子强度增加。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中回收的单PEG化的红细胞生成素在所述分步洗脱方法的第二步中被回收。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述的步骤b)中，多PEG化的红细胞生成素在穿流缓冲液的第一次离子强度增加后被回收，单PEG化的红细胞生成素在穿流缓冲液的第二次离子强度增加后被回收，未PEG化的红细胞生成素在穿流缓冲液的第三次离子强度增加后被回收。

8.根据权利要求3至7中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤b)的分步洗脱方法中，导致洗脱的盐浓度的差异在所述分步洗脱方法的各步的每一步中为120％或120％以上。

9.根据权利要求3至8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述缓冲水溶液含有磷酸或其盐或者柠檬酸或其盐或者组氨酸或其盐作为缓冲物质。

10.根据权利要求3至9中任意一项所述的方法，其特征在于，在所述的步骤d)中，通过应用线性梯度从第二阳离子交换色谱柱上回收单PEG化的红细胞生成素，所述线性梯度以pH约3.0的含有约50mM氯化钠的浓度约100mM的磷酸钾缓冲液开始，以pH约3.0的含有约500mM氯化钠的浓度约100mM的磷酸钾缓冲液结束，其中氯化钠浓度历经十倍柱体积的变化是线性的。

11.制备单PEG化的红细胞生成素的方法，其包括以下步骤：

a)将红细胞生成素PEG化，

b)使用两个连续的阳离子交换色谱步骤纯化单PEG化的红细胞生成素，其中第一个和第二个阳离子交换色谱步骤采用相同类型的阳离子交换材料，

c)从第二阳离子交换色谱柱上回收基本同质的形式的单PEG化的红细胞生成素。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述方法中，两个连续的阳离子交换色谱步骤是用不同的洗脱方法进行的。

13.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，第二阳离子交换材料与第一阳离子交换材料是相同类型的阳离子交换材料，但不是同一份阳离子交换材料。

14.根据前面任意一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述PEG残基在线性PEG的情况下具有20-35kDa的分子量，在分支PEG的情况下具有40kDa的分子量。