[发明专利]PEG化的多肽的纯化有效

专利信息
申请号: 200880024804.8 申请日: 2008-07-15
公开(公告)号: CN101889023A 公开(公告)日: 2010-11-17
发明(设计)人: J·伯格;K·雷彻特;A·施罗特;H·舒里格;A·维斯纳 申请(专利权)人: 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
主分类号: C07K14/505 分类号: C07K14/505;A61K38/18;A61K47/48
代理公司: 北京市中咨律师事务所 11247 代理人: 黄革生;贾士聪
地址: 瑞士*** 国省代码: 瑞士;CH
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摘要:
搜索关键词: peg 多肽 纯化
【说明书】:

发明属于用于纯化多肽、尤其是PEG化的红细胞生成素的色谱分离方法领域。

发明背景

在当今的医疗产品中蛋白质具有重要作用。对于人应用而言,每种治疗性蛋白质均必须符合独特的标准。为了确保生物药物对人的安全性,尤其必须除去生产过程中累积的副产物。为了满足管理规范,在生产过程之后必须进行一个或多个纯化步骤。其中,纯度、流通量和产率在确定适宜的纯化方法中起重要作用。

已确立了不同的方法并广泛用于蛋白质的纯化,例如使用微生物蛋白的亲和色谱法(例如蛋白A或蛋白G亲和色谱法)、离子交换色谱法(例如阳离子交换(磺丙基或羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的离子交换)、亲硫吸附色谱法(例如使用β-巯基乙醇和其它SH配体)、疏水作用色谱法或芳烃吸附色谱法(例如使用苯基-琼脂糖、亲氮杂-芳烃树脂(aza-arenophilic resin)或间-氨基苯基硼酸)、金属螯合亲和色谱法(例如使用Ni(II)-和Cu(II)-亲和物质)、尺寸排阻色谱法和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

针对例如聚乙二醇(PEG)和白介素-6(EP 0442724)、PEG和红细胞生成素(WO 01/02017)、包含内皮抑制素和免疫球蛋白的嵌合分子(US 2005/008649)、基于分泌的抗体的融合蛋白(US 2002/147311)、包含白蛋白的融合多肽(US 2005/0100991;人血清白蛋白US 5,876,969)、PEG化的多肽(US 2005/0114037)和干扰素融合物报道了缀合物。

Necina,R.等人(Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698)报道了用表现出高电荷密度的离子交换媒介物直接从细胞培养物上清液中捕获人单克隆抗体。在WO 89/05157中,报道了一种通过直接将细胞培养基进行阳离子交换处理纯化免疫球蛋白产物的方法。Danielsson,A.等人,J.Immun.Meth.115(1988),79-88描述了来自小鼠腹水的单克隆IgG抗体的一步纯化。在WO 2004/024866中报道了一种通过离子交换色谱法纯化多肽的方法,其中使用梯度洗脱将感兴趣的多肽与一种或多种污染物拆分开。在EP 0530447中,报道了一种通过三个色谱步骤的组合纯化IgG单克隆抗体的方法。Yu,G.等人在Process Biotechnol.42(2007)971-977中报道了单PEG化的白介素-1受体拮抗剂的温和纯化。Wang等人(Wang,H.等人,Peptides 26(2005)1213-1218)报道了通过两步阳离子交换色谱法进行的对大肠杆菌(E.coli)中表达的hTFF3的纯化。Yun等人(Yun,Q.等人,J.Biotechnol.118(2005)67-74)报道了通过两个连续的离子交换色谱步骤进行的对PEG化的rhG-CSF的纯化。WO 2007/039436和WO 01/087329报道了与聚(乙二醇)基团共价连接的红细胞生成素以及包含红细胞生成素蛋白的液体药物组合物。

发明概述

本发明包括纯化单PEG化的红细胞生成素的方法,其包括以下步骤:提供包含单-、多-和未-PEG化的红细胞生成素的溶液,进行两个连续的阳离子交换色谱步骤,和回收在第二个阳离子交换色谱步骤中纯化的单PEG化的红细胞生成素,其中在所述两个阳离子交换色谱步骤中使用相同类型的阳离子交换材料。

在所述方法的一个实施方案中,所述两个连续的阳离子交换色谱步骤是使用不同的洗脱方法进行的。在另一个实施方案中,所述两个连续的阳离子交换色谱步骤包括以下步骤:

a)在适于所述单PEG化的红细胞生成素与第一阳离子交换色谱柱中所含有的阳离子交换材料结合的条件下,将包含单-、多-和未-PEG化的红细胞生成素的混合物的缓冲水溶液加样在所述第一柱上,

b)利用穿流缓冲液的离子强度步进增加的分步洗脱方法从第一阳离子交换色谱柱上回收单PEG化的红细胞生成素,其中与步骤a)中加样的混合物相比,所述单PEG化的红细胞生成素的分数增加,

c)在适于所述单PEG化的红细胞生成素与第二阳离子交换色谱柱中所含有的阳离子交换材料结合的条件下,将回收的单PEG化的红细胞生成素加样在所述第二柱上,其中所述第二柱中所含有的阳离子交换材料与第一柱中的阳离子交换材料是相同类型的,

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