[发明专利]α-1-抗胰蛋白酶和载脂蛋白A-I的纯化方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年8月17日提交的美国临时申请第60/935,527号的优先权的权 益，并将其全部内容通过引用结合在此。

技术领域

本发明涉及来自(例如)人血浆的一个部分的α-1-抗胰蛋白酶(AAT，亦称为 α-1蛋白酶抑制剂、API、以及A₁-PI)和载脂蛋白A-I(ApoA-I)二者的蛋白分离与 纯化的方法。在某些具体实施方式中，本发明提供了在纯化的最初阶段将AAT与 ApoA-I分离的方法，这样使得同一起始材料能够被用作对于这两种蛋白的来源。 这些方法进一步涉及提供AAT和ApoA-I的组合物，这些组合物适合于药物的用途 并且适合于大规模纯化。

背景技术

许多基于蛋白的生物药剂是从人血浆分离的。原料人血浆(它们部分依赖于 志愿的血液捐赠)的有限供应结合总体上的低浓度、高脆性、以及在血浆蛋白纯 化中的有限的产率使得这种类别的药物的制造是困难的和昂贵的。因此存在这样 一种需要：提高血浆蛋白的纯化方法的效率，这样使得能够以可达到的最高的产 率从相同的人血浆样品中分离出尽可能多的医学上有关的蛋白。

由于蛋白的多样性、与每种蛋白制品有关的可能的污染物和/或杂质的性质改 变、以及对于生物药剂的生产通常需要大量的蛋白，因此对于人血浆蛋白的蛋白 分离与纯化的方法提出了独特的挑战。纯化技术总体上包括一系列纯化步骤，这 些步骤具有分离一种单一目标蛋白的目的。

α-1-抗胰蛋白酶(AAT)和载脂蛋白A-I(ApoA-I)是可以被制成生物药剂的 人血浆蛋白的实施例。已经说明了使用专用的纯化工艺来纯化这些蛋白的方法。 例如PCT公开号WO04060528说明了一种用于AAT的纯化工艺以及美国专利号 5,089,602说明了ApoA-I的纯化，每种工艺开始于人血浆部分并且各自得到一种单 一蛋白的产品。

我们现在已经发展了多种方法，这些方法允许从相同的人血浆的部分开始的 AAT和ApoA-I的纯化。这些方法适合于大规模纯化，因此为工业上适用的制造过 程提供了基础。本发明提供了用于在纯化初期将AAT与ApoA-I分离的方法，这样 使得同一起始材料能够被用作一种起始材料来纯化这两种蛋白；以及在所述分离 之后生产药物级的AAT和ApoA-I的方法。

ApoA-I是高密度脂蛋白(HDL)的一种28kDa的主要蛋白组分并且它在为排 泄或再循环进行的从外周至肝脏的胆固醇逆向转运中起一种关键作用。

特别在重建的HDL样颗粒中的ApoA-I长期以来已被说明为具有治疗的潜能。 最近刚发表的一项研究强调了这种潜能(JAMA(2007)；vo1.297，p.1675-1682)。

已经发展了多种用于ApoA-I的纯化技术。

小规模纯化ApoA1的最常见的途经之一是使用超速离心以便分离HDL，接着 从该HDL-颗粒中分离ApoA-I。存在若干不同的途径来从HDL中纯化ApoA-I，包括 溶剂提取。超速离心是一项非常耗时的方法，并且它不适合大规模的分离。

也已经说明了不包括超速离心的使用血浆作为起始材料的方法，例如：层析 纯化法(Ross S.E.等人，Rapid chromatographic purification of apolipoproteins A-I and A-II from human plasma，Analytical Biochemistry 149，p.166-168(1985))以及使用凝 胶过滤HPLC的纯化法(Tricerri A.等人.，A rapid and efficient procedure for the purification of human apolipoprotein A-I using gel-filtration HPLC，IJBC，1，p.159-166 (1994))。使用来自人血浆的冷乙醇分级分离的部分作为起始材料的其他方法也已 经被公布(Peitsch等人，A purification method for apolipoprotein A-I and A-II， Analytical Biochemistry，178.p.301-305(1989))。