[发明专利]多系祖细胞分化为软骨细胞

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2007年7月25日提交的美国临时申请号60/951,884的权益，在此将其全部内容以引用的方式纳入本文。

技术领域

本文涉及软骨细胞，更具体而言，本文涉及将来自人脐带血的多系祖细胞(MLPC)分化为软骨细胞，并从MLPC克隆系(clonal MLPC line)制备软骨细胞克隆群。

背景

已在多个来源中鉴别到骨髓清除性治疗后能造血重建的祖细胞，这些来源包括骨髓、脐带血和胎盘血，以及用干细胞动员剂量的粒细胞集落刺激因子治疗的对象的外周血。这些细胞通常称为造血干细胞(HSC)，它们是通过细胞表面糖蛋白如CD34和CD133的存在而被鉴定的。作为“骨髓移植”的一部分，HSC仅占总细胞群中非常小的比例，并被认为是该治疗中负责恢复接受清髓剂量的化疗或放疗的患者的造血功能的救命的治疗部分。经由骨髓移植的干细胞治疗已成为大量难治疗的白血病和遗传性血液疾病的标准治疗。

最近的研究提示，骨髓中存在能自我更新和分化成除血细胞以外的多种不同组织类型的更原始的细胞群。发现这些多能细胞在成人骨髓的CD34-塑性-黏附细胞群中为微量组分，并被不同地称为间充质干细胞(MSC)(Pittenger等，Science 284：143-147(1999))、或多能成人祖细胞(MAPC)(Furcht，L.T.等，美国专利公开号20040107453 A1)。MSC细胞不具有单一的特定鉴定标记，但已显示对多个标记呈阳性，包括CD29、CD90、CD105和CD73，并对其它标记呈阴性，包括CD14、CD3和CD34。各个研究组已报道，可将MSC细胞分化成肌细胞、神经元、胰腺β细胞、肝细胞、骨细胞和结缔组织。其它研究组(Wernet等，美国专利公开号20020164794A1)已揭示了来自脐带血内CD45^-/CD34^-群的具有多能性的未受限制的体干细胞(USSC)。

发明内容

本文基于以下发现：可通过诱导人胎血的多系祖细胞(MLPC)的分化而获得软骨细胞。如本文所述，基于其免疫表型特征、基因表达特征、形态学和不同的生长模式，区分胎血MLPC与来自骨髓的MSC、HSC和USSC。本文提供由个体细胞发育单型克隆细胞系的方法，以及由这些克隆细胞系产生的软骨细胞克隆群。本文还提供低温保存MLPC(如，用于脐带血库)和软骨细胞的方法。

一方面，本文描述了一种组合物，该组合物含有纯化的人胎血多系祖细胞(MLPC)群或克隆的人胎血MLPC系和有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基，其中，所述MLPC为CD9阳性，CD45阴性，CD34阴性，SSEA-4阴性。所述MLPC还可以呈CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性，且还可呈CD10、CD41、Stro-1和SSEA-3阴性。在一些实施方式中，所述MLPC还呈CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子和HLA-DR阴性。所述分化培养基可含有抗坏血酸、地塞米松、和转化生长因子β3(TGF-β3)。所述组合物还可含有生长基底。该生长基底可以包涂有胶原。例如，生长基底可以是胶原包涂的培养设备或胶原包涂的三维支架(scaffold)。该三维支架可由磷酸三钙或二氧化钛形成。

本文还描述了一种制备具有软骨细胞表型的细胞群的方法。该方法包括提供胶原包涂的二维或三维生长基底，该基底容纳纯化的MLPC群或克隆的MLPC系；和用能有效诱导所述MLPC分化成具有软骨细胞表型的细胞的分化培养基培育所述纯化的MLPC群或克隆的MLPC系，其中，所述MLPC呈CD9阳性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性。所述分化培养基可含有抗坏血酸、地塞米松和TGF-β3。该生长基底可以包涂有胶原。例如，生长基底可以是胶原包涂的培养设备或胶原包涂的三维支架。该三维支架可由磷酸三钙或二氧化钛形成。所述方法还可包括测试所述具有软骨细胞表型的细胞的胞内SOX9、胞内II型胶原、胞内聚集蛋白聚糖(aggrecan)和TGF-β受体的细胞表面表达。