[发明专利]体内扩增人类肝细胞的方法无效

专利信息
申请号: 200880100708.7 申请日: 2008-06-05
公开(公告)号: CN101809156A 公开(公告)日: 2010-08-18
发明(设计)人: 马库斯·葛洛佩;希萨雅·阿祖吗;姆森·奥-达利米;马克·A·凯 申请(专利权)人: 俄勒冈健康科学大学;利兰·斯坦福初级大学理事会
主分类号: C12N15/85 分类号: C12N15/85;A01K67/027;C12N15/861;C12N5/06
代理公司: 中原信达知识产权代理有限责任公司 11219 代理人: 张颖;樊卫民
地址: 美国*** 国省代码: 美国;US
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摘要:
搜索关键词: 体内 扩增 人类 肝细胞 方法
【说明书】:

与相关申请的交叉引用

本申请要求2007年6月5日提交的美国临时申请No.60/933,432的优先权益,该临时申请在此以其全文引为参考。

关于政府支持的陈述

发明在美国政府的支持下,在国立卫生研究院国家糖尿病和消化及肾脏疾病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive andKidney Diseases of the National Institutes of Health)的资助DK051592下作出。美国政府在本发明中拥有一定权利。

技术领域

本公开涉及用于扩增人类肝细胞的方法,具体来说涉及利用免疫缺陷小鼠扩增人类肝细胞的方法。

背景技术

肝脏是异生化合物、包括医用药物代谢的重要位点。因为许多肝酶是种属特异性的,因此必需使用培养的初级人类肝细胞或它们的微粒体级份,来评估候选药物的代谢(Brandon等,Toxicol.Appl.Pharmacol.189:233-246,2003;Gomez-Lechon等,Curr.Drug Metab.4:292-312,2003)。尽管微粒体肝细胞级份可用于阐释某些代谢功能,但其它的测试依赖于活的肝细胞。例如,某些化合物诱导肝酶,因此它们的代谢随着时间而变化。为了分析酶的诱导,肝细胞不仅必须是活的,而且是完全分化和有功能的。

对于药物代谢和其它研究来说,典型情况下肝细胞从器官供体的遗体分离,并运送到要进行测试的场所。遗体来源的肝细胞的状态(存活性和分化状态)是高度不同的,许多细胞制备物的质量勉强合格。高质量人类肝细胞的可获得性受到了下述事实的进一步妨碍,即它们不能在组织培养中大量扩增(Runge等,Biochem.Biophys.Res.Commun.274:1-3,2000;Cascio S.M.,Artif.Organs 25:529-538,2001)。在铺板后,细胞存活,但是不分裂。来自容易获得的哺乳动物物种、例如小鼠的肝细胞,不适合于药物测试,因为它们具有不同的成套代谢酶,并在诱导研究中响应不同。永生的人类肝脏细胞(肝细胞瘤)或胚胎成肝细胞也不足以代替完全分化的成年细胞。在微生物学领域也需要对人类肝细胞进行研究。许多人类病毒,例如引起肝炎的病毒,不能在任何其它细胞类型中复制。

由于这些限制,扩增初级人类肝细胞的方法是高度需要的。因此,本文提供了用于扩增人类肝细胞的强有力的系统。

发明概要

本文提供了体内扩增人类肝细胞的方法。方法包括将分离的人类肝细胞注射到免疫缺陷小鼠中,允许肝细胞扩增,以及收集人类肝细胞。

在几个实施方案中,将人类肝细胞施用于免疫缺陷接受体小鼠,其中小鼠还缺陷延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)。在某些实施方案中,小鼠是Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)小鼠。在其它实施方案中,小鼠是Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-/-(FpmRG)小鼠。在本方法的某些实施方案中,在注射人类肝细胞之前,将编码人类尿激酶的载体施用于小鼠。在其它实施方案中,在肝细胞注射前,从小鼠消除了巨噬细胞。

在某些实例中,人类肝细胞在接受体小鼠、例如FRG小鼠或FpmRG小鼠中扩增至少大约2周。从接受体小鼠收集扩增的人类肝细胞。在一个实施方案中,将分离的人类肝细胞注射到接受体小鼠的脾脏中,并从小鼠的肝脏收集扩增的人类肝细胞。收集的肝细胞可以被导入另一个接受体小鼠,例如FRG小鼠或FpmRG小鼠,用于进一步扩增。因此,方法可以重复使用,以进一步扩增人类肝细胞。

在本文提供的方法的一个实施方案中,在肝细胞注射之前,对Fah缺陷的小鼠施用抑制、阻止或延迟肝脏疾病发生的药剂。一种这样的药剂是2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1,3环己二酮(NTBC)。NTBC或其它适合的药剂,可以通过任何适合的手段施用,包括但不限于在饮用水中,在食物中,或通过注射。任选,在肝细胞注射后,NTBC还施用至少大约3天到至少大约6天。

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