[发明专利]基于空间位阻和酶相关信号放大的高特异性和高灵敏度检测

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年5月31日提交的美国临时专利申请号60/941,057的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。

在联邦资助研发下作出发明的权利的声明

本发明本发明在NIH/NIDCR基金号UO1DE 017790、UO1DE015018和RO1DE017593以及NASA/NSBRI基金号TD00406的政府资助下作出。政府对本发明享有一定权利。

发明背景

1.发明领域

本发明涉及核酸探针和试验方法。

2.相关领域描述

就地(point-of-care)检测的要求之一是检测混合物中的少量靶分子。由于任何混合物的复杂性，检测低数量靶需要高灵敏度以及高特异性。然而，现有技术检测方法需要在特异性和灵敏度之间作出妥协。开发了几种技术以获得信号扩增，从而有助于增加灵敏度。在大多数检测方法中，信号强度与检测区域内靶的数量(与整个样品体积相比通常极少)相关。因此，无论是扩增整个样品体积中的靶数量还是在小的检测区域内累积靶均有助于提高信号强度。

第一种方法增加靶、探针和/或信号的总量，因而能获得高强度检测结果。例如，PCR，引物原位标记(PCR，Primed in situ labeling)(PRINS)和基于核酸序列的扩增(NASBA)技术应用于增加靶总量。参见Monis和Giglio，InfectionGenetics and Evolution，2006.6(1)：第2-12页。连接酶链式反应(LCR)和滚环扩增(RCA)能扩增探针。支链DNA(bDNA)和酪胺信号扩增(TSA)能扩增信号。参见Andras等，Molecular Biotechnology，2001.19(1)：第29-44页。

与直接扩增靶/探针/信号相比，第二种方法致力于增加靶的局部浓度而不是产生该靶的更多拷贝。例如，纳米技术通过应用基于纳米颗粒的技术将样品内少数拷贝的靶聚集到检测区域中。同时增加靶的总量和局部浓度导致高灵敏度。然而，这样也会产生较高的背景水平和更多的假阳性结果，因为同时放大了特异性和非特异性信号。

在另一方面，现已设计了高特异性探针来降低背景噪声水平，例如分子信标(molecular beacon)和具有约束性结构的其它探针。参见Wei等，Journal of theAmerican Chemical Society，2005.127(15)：第5306-5307页；Broude，Trends inBiotechnology，2002.20(6)：第249-256页；Fan等，Trends in Biotechnology，2005.23(4)：第186-192页；Tyagi和Kramer，Nature Biotechnology，1996.14(3)：第303-308页。这些方法通常基于距离灵敏性信号转导过程(distance sensitivesignal traducing process)，例如FRET，增补染料(Howell等，Genome Research，2002.12(9)：第1401-1407页)和电化学方法。在这些方法中，特异性靶的结合会导致探针的构象变化。构象变化将显著转换成信号打开(ON)状态。然而，通过改善特异性，那些探针的检测极限降低，因为可检测信号需要大量靶，因此会在检测系统中引入更多假阳性结果。

因此，仍需要能提供高特异性和高灵敏度检测的试验方法和试剂。

发明概述

本发明总体上涉及探针和试验方法。