[发明专利]通过数字PCR对核酸的分析

权利要求书

1.分析样品中核酸的方法，其包括下述步骤：

(i)从所述样品制备多个相等的组分，其中多于50％的所述组分中每组分含有不多于1个靶核酸分子；

(ii)使用至少一种正向引物与至少两种反向引物，或者使用至少两种正向引物与至少一种反向引物在每个组分中进行扩增反应，其中每种所述正向或反向引物具有不同并且确定的核苷酸序列；

(iii)在每个组分中检测从每对正向和反向引物扩增的核苷酸序列；以及

(iv)计数检测出从不同对的正向和反向引物扩增的核苷酸序列的不同组合的组分的数目，从而确定所述样品中不同长度的所述靶核苷酸的相对量。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个相等组分是来自所述样品的多个相等的稀释物。

3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(i)是通过微流体系统进行的。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述扩增反应是聚合酶链式反应(PCR)。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述PCR是实时PCR。

6.如权利要求4所述的方法，其中在所述PCR中存在荧光染料。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述荧光染料是SYBR Green或LC Green。

8.如权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(i)或步骤(ii)前的逆转录步骤。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述从不同对的正向和反向引物扩增的核苷酸序列具有不同的长度。

10.如权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)是通过乳液聚合酶链式反应进行的。

11.如权利要求1所述的方法，其中步骤(iii)是通过熔融曲线分析进行的。

12.如权利要求9所述的方法，其中步骤(iii)是通过电泳进行的。

13.如权利要求1所述的方法，其中步骤(iii)是通过利用带有可检测标记物的探针的序列特异性杂交进行的，其中每种探针具有不同的可检测标记物并且特异性地与从一对正向和反向引物扩增的核苷酸序列杂交。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述可检测标记物是不同的荧光分子。

15.如权利要求1所述的方法，其中步骤(iii)是通过引物延伸反应或通过测序反应进行的。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述引物延伸反应的产物通过质谱法检测。

17.如权利要求1所述的方法，其中步骤(iii)是通过流式细胞术进行的。

18.如权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)和(iii)是通过BEAMing进行的。

19.如权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)中的所述扩增反应使用不同对的正向和反向引物连续地进行。

20.如权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)中的所述扩增反应使用不同对的正向和反向引物同时进行。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述样品来自孕妇。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述样品是血液、血浆、血清、唾液或宫颈灌洗样品。

23.如权利要求21所述的方法，其中每个所述靶核酸包含染色体13、18、21、X或Y的至少一部分。

24.如权利要求21所述的方法，其中每个所述靶核酸包含与遗传疾病或遗传多态性有关的基因的至少一部分。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述基因是β-球蛋白基因或囊性纤维化跨膜传导调节因子基因。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述遗传多态性是单核苷酸多态性(SNP)。

27.如权利要求1所述的方法，其中所述样品来自癌症患者。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症是鼻咽癌、淋巴癌、肝细胞癌或宫颈癌。

29.如权利要求27所述的方法，其中所述样品是血液、血浆、血清、唾液或肿瘤组织。