[发明专利]通过数字PCR对核酸的分析

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2007年8月3日提交的第60/953,872号美国临时专利申请的优先权，该临时申请的公开内容被通过引用的方式整体并入本文。

发明背景

核酸大小的分析用于许多研究和诊断应用中。诸如琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳的电泳通常用于分析核酸的大小。质谱法也用于分析核酸大小，因为不同大小的核酸片段，例如那些通过引物延伸反应制备的核酸，具有不同的分子量(Ding and Cantor，2003，Proc Natl Acad Sci USA，100，7449-7453)。

下面是核酸大小分析的用途的一些实例。例如，能够通过用限制性酶处理，然后通过分析处理的产物的大小来检测产生限制性酶切位点的突变的存在。特定大小的较短片段的存在表明存在突变。相反地，对应于非限制性状态的较长DNA片段的存在表示没有突变。如果所用的限制性酶对靶DNA片段的甲基化状态是敏感的，则这种分析还能够用于分析DNA甲基化。因此，如果使用只切割未甲基化的DNA的酶，则较短的限制酶切DNA片段表示存在未甲基化的DNA。相反地，较长的非限制性DNA片段的存在表示存在甲基化的DNA。如果使用切割甲基化的DNA而不切割未甲基化的DNA的酶，诸如McrBC(Sutherland，et al.1992，J Mol Biol，225，327-348)，这些结果的解释将是相反的。

作为另一实例，已知母体血浆中的无细胞胎儿DNA的大小小于母体DNA(Chan，et al.2004，Clin Chem，50，88-92；Li，et al.2004，ClinChem，50，1002-1011)(还参见，第03405742.2号欧洲专利申请“Non-invasive detection of fetal genetic traits(胎儿遗传特征的无创检测)”)。因此，通过电泳的大小分级已经用于富集母体血浆中的胎儿DNA(Li，et al.2005，JAMA，293，843-849)

在肿瘤学领域中，已经在癌症患者中观察到了增加的DNA完整性(Hanley，et al.2006，Clin Cancer Res，12，4569-4574；Jiang，et al.2006，Int J Cancer，119，2673-2676；Umetani，et al.2006，J Clin Oncol，24，4270-4276；Wang，et al.2003，Cancer Res，63，3966-3968)(还参见第6,964,846号美国专利)。这种现象被认为涉及与肿瘤相关的坏死改变。通过对不同大小的扩增子各自的实时PCR测定分析了癌症患者中的DNA完整性。Exact Sciences还拥有专营的DNA完整性测定(更多信息参见网页exactsciences.com/applied/applied.html)。

DNA大小分析还用于分析源自病毒的核酸序列，例如鼻咽癌患者和某些淋巴癌患者血浆中的EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)DNA的大小(Chan，et al.2003，Cancer Res，63，2028-2032)。核酸大小分析还用于测量RNA的完整性(Wong，et al.2006，Clin Cancer Res，12，2512-2516；Wong，et al.2005，Clin Chem，51，1786-1795)。这种分析可以用于临床诊断，因为已经在癌症患者中观察到了降低的RNA完整性。还已表明，孕妇血浆中的胎盘RNA由部分降解的片段组成，并且具有5’优势(Wong，et al.2005，Clin Chem，51，1786-1795)。有人指出氧化应激会降低这些胎盘来源的mRNA的完整性(Rusterholz，et al.2007，Fetal Diagn Ther ，22，313-317)。数字PCR及随后的DNA测序已经用于分析结肠直肠肿瘤患者中血浆DNA的大小分布(Diehl，et al.2005，Proc Natl Acad Sci USA，102，16368-16373)。

本发明提供了用于分析核酸大小，特别是源自相同的较长序列的核酸的大小，以及测试样品中不同长度的这些核酸的相对丰度的新方法。

发明概述