[发明专利]用于微阵列制备的基于3′的测序方法

说明书

优先权声明和相关申请的交叉引用

本申请要求于2007年8月13日递交的美国临时专利申请第60/964,470号的优先权，该临时专利申请通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及使用核苷酸的3′-测序来设计核酸微阵列的方法。本发明还涉及使用3′-测序来鉴定组织转录组的方法。

背景技术

由Affymetrix和其它微阵列公司制备的常用DNA微阵列是由公开数据产生的。虽然大部分阵列经设计具有3′-偏好，但是探针设计所用的序列数据仍取自主要通过5′-测序得到的公共数据库。这些序列在序列的3′-末端几乎是完整的，但并不包括(account for)序列的3′-末端的可变聚腺苷酸化，因为它们在不同组织和疾病背景中表达。

例如，据估计超过29％的人基因具有可变聚腺苷酸化[poly(A)]位点(Beaudoing，E(2001)Genome Res.，11，1520-1526)。可变poly(A)位点的选择被认为与生物学状况，如细胞类型和疾病状态有关(Edwalds-Gilbert，G et al.(1997)Nucleic Acids Res.，25，2547-2561)。当3′-末端外显子被可变剪接时，涉及可变聚腺苷酸化。根据组织或疾病状态，可变聚腺苷酸化会产生具有可变3′-末端的mRNA或具有不同C-末端的蛋白质。已经发现越来越多的基因受这种机制的调节。虽然正在努力构建可变聚腺苷酸化位点的数据库，但是目前尚不了解所有此类位点(Zhang et al.Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，Database issue D116-D120)。此外，在设计组织特异性或疾病特异性微阵列时，对可变聚腺苷酸化缺乏关注会导致次优的基因表达谱以及最终使用时的假阴性和假阳性结果。源自公共数据库的微阵列并不包括可变聚腺苷酸化。在公共数据库中没有大量的3′-测序，也没有很好地代表主要的可变3′-聚腺苷酸化。

另有文献报道组织特异性聚腺苷酸化经常出现，因此这也进一步强调了建立在目标疾病或组织中表达的真实3′-末端的重要性。超过三分之一的人前体mRNA经历可变RNA加工修饰，这使其成为普遍的生物学过程。所产生的蛋白同种型具有不同的且有时相反的功能，更强调了此过程的重要性。哺乳动物物种中的大量基因可能经历可变聚腺苷酸化，从而产生具有可变3′-末端的mRNA。由于mRNA的3′-末端常包含对mRNA稳定性、mRNA定位和翻译重要的顺式元件，所以聚腺苷酸化调节的意义可能是多方面的。可变聚腺苷酸化由顺式元件和反式因子控制，且被认为以组织或疾病特异性的方式发生。考虑到在mRNA代谢的其它方面(如转录起始和剪接)有许多可以利用的数据库，而关于聚腺苷酸化(包括可变聚腺苷酸化及其调控)的系统信息则显著缺乏。

因此，获得与特定组织和疾病状态对应的序列的真实3′-末端对于微阵列检测的改进非常重要。

发明内容

本文提供了使用设计序列制备微阵列的方法，所述设计序列来自通过3′-测序进行测序的RNA转录本。这些方法可产生组织特异性和疾病特异性微阵列，所述微阵列包含在常规阵列上不存在的针对可变聚腺苷酸化的转录本形式的探针。这些方法提供了当最终用于表达谱分析(expression profiling)或诊断或预后方法时具有使假阳性和假阴性结果减少的阵列。

此外，本领域的普通技术人员可以理解，存在大量与组织类型和疾病状态有关的可变3′-聚腺苷酸化的转录本形式。针对这种可变性，本发明提供了转录本的高通量3′-测序方法，以从所研究组织或疾病中鉴定转录本的真实3′-末端。

在一个实施方式中，从3′-最末端(extreme 3’end)起对转录本测序，以得到考虑了可变聚腺苷酸化位点的该组织或疾病状态特异的3′-末端序列。随后，将得到的最末端3′-序列(extreme 3’sequence)作为用于设计探针和产生阵列的设计序列。

在另一个实施方式中，对分离RNA样品中的转录本进行高通量3′-测序，直到对RNA样品中的基本上所有转录本都进行了测序。随后将这些最末端3′-序列作为用于设计探针和产生阵列的设计序列。与标准的商购阵列相比，本文所述的方法使阵列具有更多的最末端3′-偏好。用于微阵列的探针设计中的3′-偏好涉及最后的300个碱基。然而，重要的区别在于设计序列的产生。在3′-测序中获得转录本的实际3′-末端，并根据确定为在目标组织或疾病状态中表达的转录本的真实和正确3′-末端的实际序列来设计阵列。