[发明专利]优化的重组生长因子蛋白纯化方法

说明书

描述

本发明涉及用于重组生长因子蛋白的有效原核生物生产和纯化的改进方法。更特别地，本发明涉及导致更好的蛋白产量、更高的产品纯度以及所述方法的改善的工业应用的程序改进。

生长和分化因子(GDF)是促进细胞增殖/分化和组织再生的同型二聚细胞因子。在大范围的医学应用中有用的GDF是生长/分化因子5(GDF-5)。尤其是过去已经成功地应用了GDF-5的成骨特性，即，帮助局部骨折的愈合。具有重叠生物功能和非常高氨基酸同源性的GDF-5的非常近的亲缘物质是GDF-6和GDF-7。GDF-5/-6/-7在哺乳动物中是保守的，但在无脊椎动物中不具有已知的同源基因(Ducy和Karsenty 2000，Kidney Int.57，2207-2214)。

在体内，该蛋白家族的成员最初作为大的前体蛋白合成，其随后在离C-末端大约110-140个氨基酸的碱性残基簇处经历蛋白水解裂解地，因此从N-末端前结构域释放出生物活性C-末端成熟蛋白部分。所有成熟多肽在结构上是相关的并含有保守的生物活性结构域，其含有六个或七个标准半胱氨酸。这些残基之间的二硫桥键有助于该蛋白家族的典型三维“半胱氨酸-结”基序。

在过去已经实现了在原核宿主中表达成熟GDF-5(参见，例如，Biochem.Biophys.Res.Commun.，204，pp.646-652，1994)。然而，这些蛋白不能容易地制得纯化形式。

当在大肠杆菌中大规模表达时，所需的蛋白通常趋于形成具有14kDa大小的单体且无活性的蛋白，其在包含体中累积。为了获得二聚的生物活性生长因子(28kDa)，必需将单体包含体蛋白溶解，纯化并复性成具有典型半胱氨酸-结结构的同型二聚体。通常将该程序称为“重折叠”。

由于在pH值为pH4至pH9之间的水溶液中非常低的溶解性以及其他不常见的蛋白质特征，在原核生物中产生的GDF-5相关蛋白的纯化和重折叠必需涉及几个特别修改的程序步骤。例如，由于重折叠的GDF-5相关蛋白趋于吸收至色谱树脂上，已经清楚的是不能根据标准的纯化实验方案和含水色谱成分来实现大规模生产中所需蛋白的纯化。一旦蛋白得到重折叠，利用有机溶剂的主要纯化方法(如反向色谱)是适用的。

WO 96/33215中公开了最近研发的重组产生的GDF-5相关蛋白的生产和纯化方法。该方法是基于在重折叠程序之前单体蛋白的纯化，并且包括以下主要步骤：

1.细菌培养、细胞破坏和包含体的回收，

2.用变性剂处理来获得溶解的单体，

3.通过离子交换色谱分离，

4.磺化(该磺化步骤是任选的)，

5.通过凝胶过滤色谱分离，

6.重折叠，

7.通过等电点沉淀回收，和

8.通过反向色谱分离。

尽管如上所述的程序基本上是适用的，但该方法在头两个处理步骤中遇到了一些困难，这两个步骤都影响目标蛋白的产量和纯度。可获得的GDF-5相关蛋白产量明显低于理论预期的，主要是由于包含体蛋白溶解过程中与不常见的混浊/粘滞溶液相关的部分降解事件。因此，明显的是应当对所公开的工艺参数和条件进行改进。

本发明的目的是克服上述问题并优化重组GDF-5相关蛋白的产量和纯度。

通过研发下文中公开的用于在大肠杆菌中生产重组GDF-5相关蛋白的改进方法解决了这些目的。

在本发明的详述之前，应当将一些常用的术语进行限定和解释，如下：

如在此所用的术语“半胱氨酸-结结构域”意指公知的且保守的富含半胱氨酸氨基酸的区域，其存在于TGF-β超家族蛋白如即人GDF-5的成熟部分中，并形成称为半胱氨酸-结的三维蛋白结构。在该结构域中，半胱氨酸残基彼此的各自位置是重要的并且只允许略有改变，使得没有失去生物活性。已经证明了单独的半胱氨酸-结结构域对于蛋白的生物功能就足够了(Schreuder等(2005)，Biochem Biophys ResCommun.329，1076-86)。半胱氨酸-结的共有序列是本领域公知的。根据在此限定的定义，蛋白的半胱氨酸-结-结构域开始于参与各自蛋白的半胱氨酸-结的第一个半胱氨酸残基，结束于其前面为参与各自蛋白的半胱氨酸-结的最后一个半胱氨酸的残基。例如，人GDF-5前体蛋白(SEQ ID NO：1)的半胱氨酸-结结构域由氨基酸400-501组成(请参阅图1)。