[发明专利]选择具有特异性突变的植物的方法

说明书

本发明涉及选择具有特异性突变的植物的方法。特别地，本方法涉及选择具有位于需要的基因组区域中的能够引起改善的遗传变异和改善的表型的突变的植物的方法。

优良种质的育种是耗时且昂贵的过程。一旦建立了优良品系，育种者将避免与不适合种质进行传统杂交和以不适合种质进行的选择方法学，因为这将瓦解品系的最佳遗传构成。相反地，人们有越来越多的兴趣通过使用突变诱导技术在特异性育种品系中产生遗传变异。在2316种正式注册的携带新型诱导的变异的品种(IAEA关于正式注册的突变品种的数据库)中反映出诱导的突变对作物改善的影响。此外，这些品种中大约四分之三是来源于经伽马射线处理的直接突变品种，因此强调了通过突变产生遗传品种的重要性。所有这些转变为对农业和食品生产的巨大的经济影响，其目前以数十亿美元和数百万种植公顷而计算。但是，虽然已经很好地理解了诱导突变对于农业的潜力，但是仍然存在有关使用突变的待解决的问题。

诱变试剂可分成三类：物理的(例如伽马射线)、化学的(例如甲磺酸乙酯，EMS)和可转座的元件(例如转座子、逆转座子、T-DNA、逆转录病毒)。目前，有关在植物分子水平上诱导的遗传效应的范围和这些不同类别试剂及其引起的突变的特异性和相对有效性可以获得的数据很有限。这些效应包括DNA损伤，其导致碱基对改变(单一/简单核苷酸多态性，SNP)；小的插入和删除(indel)和染色体重排。对于诱导突变如何与表观遗传(epigenetic)过程例如甲基化、逆转录元件的激活和较高级别DNA结构的扰乱相互作用了解的更少。

虽然育种者已经使用突变诱导来拓宽种质的遗传基础，并且已经使用突变品系直接作为新品质或在杂交育种程序中作为新变异的来源，但是对于诱导的突变的确切本质的了解不是必需的。直观上保守性水平的小的碱基对重排和删除被认为是理想的。如今，诱变技术的使用已经超出育种上的应用而扩展至基因发现和反向遗传学。这些新的高通量应用需要在整个作物植物基因组上以高效性诱导的特异类别的突变，因此，关于诱导的突变的确切本质的知识正成为一个问题。

经典的高通量基因发现方法高度依赖于插入的“敲除”品系，现在为经典的“基因机器”，以及删除“敲除”库。插入突变包括诱导已知的可转座元件的转座活性以产生一系列品系，理论上在这些品系中基因组中每个基因将被转座子插入灭活。这些品系可用于鉴定引起特定表型的基因，或相反地可用于通过搜寻与特定的已知基因的灭活相关的表型而鉴定基因功能。但是，插入突变具有以下缺点：基因功能被严重扰乱，通常呈现出全基因敲除。在很多情况下，想要的突变是改变一个基因而不是消除它。与插入突变比较，常规突变诱导(特别是化学试剂例如EMS)提供了诱导点突变的优势并因此提供了广泛的潜在的等位基因变异。

一种相对新颖和重要的反向遗传学方法是“定向诱导基因组局部突变(targeting induced local lesions in genomes，TILLING)”。其中，在一系列品系中诱导大量的小的变化，或者是DNA碱基对取代，或者是跨越不超过几个碱基对的小的删除。在这些品系中可以通过将表型与特定基因中的变化相关联而确定基因的功能，并且可以产生已知基因的新的等位基因。

在未来的几年中，像这样的新技术将对实践中的植物育种产生渐增的影响。为了适应突变过程，需要这样的技术，使得在基因组的所需部分内含有突变的突变体的选择更加容易。而且，需要一些技术以从大量的突变体中进行选择，在那些突变体中已经以稳定形式引入了突变，即可用于育种并在基因组中分布。过去这是不可能的，因为缺少分析工具和方法学。现在，高通量DNA测序方法(包括，特别是平行测序方法，单分子测序)提供了上述缺失连接的一部分。一个很好的例子是例如在申请人的技术和另案待审的申请中提供的所描述的Keypoints(WO2007037678)。

但是，使用Keypoints来选择特定基因中的诱导的突变在实践中可能被限制为特异性制造的诱变的群体，其被存储为M2或甚至更远代近亲繁殖群体。在实践中最初诱变的M1种子的至少一个自交被视为对于消除DNA分析前的体细胞嵌合性是必要的。因为对于构建并繁殖这样一个诱变群体所投资的时间和资源是相当可观的，所以它们通常是稀少的并且通常不包含育种者作物的优良种质的显著性部分。对于诱变群体在改善优良育种材料中的实际应用，这是严重的缺陷。因此，存在发明在任何育种品系和在育种程序的任何阶段或谱系中允许诱变并选择突变的方法的需要。