[发明专利]突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶以及使用该酶的非天然氨基酸整合蛋白质的制造方法

权利要求书

1.突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其为序列号2所示的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的氨基酸序列中，选自构成吡咯赖氨酸结合位点的306位的酪氨酸、309位的亮氨酸和348位的半胱氨酸中的至少1个氨基酸残基被替换而得到的突变体酶，该氨基酸替换是：

306位的酪氨酸替换为甘氨酸或丙氨酸，

309位的亮氨酸替换为甘氨酸或丙氨酸，和

348位的半胱氨酸替换为缬氨酸、丝氨酸或丙氨酸。

2.根据权利要求1记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，还包括384位的酪氨酸替换为苯基丙氨酸或组氨酸的氨基酸替换。

3.根据权利要求2记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，所述氨基酸替换包括306位的酪氨酸替换为丙氨酸，和384位的酪氨酸替换为苯基丙氨酸的双重替换。

4.根据权利要求2记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，所述氨基酸替换包括309位的亮氨酸替换为丙氨酸，和384位的酪氨酸替换为苯基丙氨酸的双重替换。

5.根据权利要求2记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，所述氨基酸替换包括309位的亮氨酸替换为丙氨酸，348位的半胱氨酸替换为缬氨酸，和384位的酪氨酸替换为苯基丙氨酸的三重替换。

6.根据权利要求1～5任一项记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其特征在于，包含306位，309位，348位和384位以外的1个或多个氨基酸缺失、替换或添加而成的氨基酸序列，并且能够将Nε-苄氧羰基赖氨酸氨基酰化。

7.突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其由野生型吡咯赖氨酰-tRNA合成酶而得，所述野生型吡咯赖氨酰-tRNA合成酶为序列号2所示的氨基酸序列的同源物，即源自甲烷八叠球菌属的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，其中，将所述同源物的氨基酸序列与序列号2所示的氨基酸序列进行序列比对时，序列号2所示的氨基酸序列的306位所对应的酪氨酸被替换为丙氨酸，和/或384位所对应的酪氨酸被替换为苯基丙氨酸。

8.编码权利要求1～7任一项记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的、经分离得到的DNA。

9.表达载体，其为在导入宿主细胞时，在该宿主细胞内能够产生权利要求1～7任一项记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的表达载体，该表达载体被功能性地结合于所述宿主细胞内的表达控制序列，并且包含权利要求8记载的DNA。

10.真细菌，其特征在于，经权利要求9记载的表达载体转化而成。

11.大肠杆菌，其特征在于，经权利要求9记载的表达载体转化而成。

12.哺乳动物培养细胞，其特征在于，经权利要求9记载的表达载体转化而成。

13.非天然氨基酸整合蛋白质的制造方法，其特征在于，使

(a)能够将N^ε-苄氧羰基赖氨酸衍生物活化的氨基酰tRNA合成酶，

(b)在所述氨基酰tRNA合成酶的存在下能够与N^ε-苄氧羰基赖氨酸衍生物结合的抑制基因tRNA以及，

(c)编码希望的蛋白质的基因，所述蛋白质在希望的位置上接受了无义突变或移码突变，

在所述N^ε-苄氧羰基赖氨酸衍生物的存在下，在细胞内或细胞提取液内表达。

14.根据权利要求13记载的方法，其中，所述氨基酰tRNA合成酶是权利要求1～5任一项记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶。

15.根据权利要求13或14记载的方法，其中所述N^ε-苄氧羰基赖氨酸衍生物是N^ε-邻碘-苄氧羰基赖氨酸、苄氧羰基-氨基乙基-硒基半胱氨酸、N^ε-邻乙炔基-苄氧羰基赖氨酸、N^ε-邻叠氮基-苄氧羰基赖氨酸或N^ε-三氟甲基二吖丙因基-苄氧羰基赖氨酸。

16.非天然氨基酸整合蛋白质合成试剂盒，其包括：

(a)细胞提取液，

(b)包含N^ε-苄氧羰基赖氨酸衍生物的非天然氨基酸，

(c)权利要求1～7任一项记载的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶，以及

(d)在所述突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶的存在下能够与N^ε-苄氧羰基赖氨酸衍生物结合的抑制基因tRNA。