[发明专利]突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶以及使用该酶的非天然氨基酸整合蛋白质的制造方法

说明书

技术领域

[相关申请的记载]

本发明基于日本专利申请：日本特愿2007-243574号(2007年9月20日申请)主张优先权，该申请记载的全部内容作为引用，记载于本说明书中

本发明涉及突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶和使用其的非天然氨基酸整合蛋白质的制造方法。更具体地，涉及使用源自甲烷八叠球菌属的突变体吡咯赖氨酰-tRNA合成酶和抑制基因tRNA(suppressertRNA)，将N^ε-苄氧羰基赖氨酸衍生物位点特异性地导入目的蛋白质的方法。

背景技术

将蛋白质中的希望的位置的氨基酸残基用通常的蛋白质合成所涉及的20种类以外的氨基酸(非天然氨基酸)替换而得到的非天然氨基酸整合蛋白质(全蛋白质，alloprotein)，能够成为用于蛋白质的结构·功能解析的有效手段。使用源自各种生物种类的氨基酰-tRNA合成酶(aaRS)/tRNA对，已经合成了30种类以上的全蛋白质。历史最长并且应用于许多有用非天然氨基酸导入的体系为，酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)突变体与经琥珀抑制基因化tRNA^Tyr的对。就该方法而言，成为关键的是下述正交(orthogonal)的关系，即，真细菌、与古细菌和真核生物这两个组中的aaRS在各自的组内将tRNA氨基酰化，但不能将其它组的tRNA氨基酰化。例如，古细菌詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的TyrRS/tRNA^Tyr对在大肠杆菌的体系中成为正交的对，相反地，大肠杆菌TyrRS与脂肪嗜热芽孢杆菌tRNA^Tyr的对在哺乳动物细胞的体系中成为正交的对，因此可以用于它们体系中的遗传密码的扩增(例如，参考专利文献1和非专利文献1)。

另一方面，源自马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和琥珀抑制基因tRNA^Pyl，在大肠杆菌细胞内作为具有正交性的aaRS/tRNA对而发挥功能(例如，参考非专利文献2)。进而，还报道了该对即使在真核细胞内也能够用于遗传密码的扩增(例如，参考专利文献2)。吡咯赖氨酸(Pyrrolysine)是在侧链上具有大体积甲基吡咯啉部分的赖氨酸衍生物。野生型PylRS能够在大肠杆菌内使N^ε-Boc-L-赖氨酸与tRNA^Pyl结合(参考专利文献2)。另外，报道了野生型PylRS与ATP类似物、吡咯赖氨酸或吡咯赖氨酸类似物的复合物的X射线结晶结构(参考非专利文献3，4和9)。

专利文献1：国际公开第2004/070024号小册子

专利文献2：日本特开2007-37445号公报

非专利文献1：Sakamoto，K.et al.，Nucleic Acids Research，2002，Vol.30，pp.4692-4699.

非专利文献2：Blight S.K.et al.，Nature，(2004)Vol.431，pp.333-335.

非专利文献3：Yanagisawa，T.et al.，Acta Cryst.(2006)F62，1031-1033

非专利文献4：Kavran，J.M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(2007)Vol.104，pp.11268-11273

非专利文献5：Tsao，M.-L.，Tian，F.，Schultz，P.G.ChemBioChemVol.2005，Issue 6，pp.2147-2149

非专利文献6：Ohno，S.et al.，J.Biochem.(Tokyo)Vol.141，pp.335-343(2007)

非专利文献7：Mukai，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol.371，pp.818-822(2008)

非专利文献8：Liu，W.et al.，Nat.Methods.Vol.4，pp.239-244(2007)

非专利文献9：Yanagisawa，T.et al.，J.Mol.Biol.(2008)378，634-652

发明内容

发明要解决的课题

以上的专利文献1、2和非专利文献1～9公开的内容，在本说明书中作为引用而被引入记载。以下，提供本发明涉及的相关技术的分析。