[发明专利]来源于抗-VP6骆驼科动物抗体的单体VHH结构域、二聚体结构域、免疫方法、轮状病毒检测方法、组合物、用于轮状病毒感染的预防和治疗方法

说明书

本发明涉及来源于抗-VP6骆驼科动物抗体的单体VHH结构域、二聚体结构域、免疫方法、轮状病毒检测方法、组合物、用于轮状病毒感染的预防和治疗方法。更具体地，本发明涉及来源于骆驼科动物抗体的单体结构域(VHH)，其中所述结构域可以是SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ IDNo.3或SEQ ID No.4中所示的任一种氨基酸序列，且其中所述结构域结合A组轮状病毒的蛋白VP6。

发明背景

A组轮状病毒(RV)是在儿童和许多有经济学利益的动物物种(牛、猪马、南美洲骆驼等等)的幼崽中严重腹泻的主要原因。作为公共健康问题，在发展中国家中，RV是第三大最常见的与严重腹泻有关的死亡的原因(每年200万例死亡)。在另一个方面，在意欲用于消费的动物如小牛中的RV-引起的腹泻导致与预防或治疗相关的高成本。

A组RV是由三联蛋白衣壳组成的颗粒。外衣壳表面由蛋白VP4和VP7组成，该两种蛋白是高度可变的抗原；迄今为止，至少已经记述了27种VP4(P-型)变体和16种VP7(G-型)变体。每种G-P型组合诱导与其他G-P型具有低交叉反应性的中和抗体；因为该原因，在疫苗中需要包括在目标物种中循环的不同毒株。

中间衣壳由三聚体蛋白VP6组成，其代表51％的病毒体质量。取决于在蛋白VP6中存在或不存在两种不同的表位(由单克隆抗体mAb255/60和631/9识别)，A组RV毒株另外分类为I，II，I+II和非I非II亚组(Sb)。人RV通常为Sb II，而动物RV主要为Sb I。蛋白VP6是高度免疫原性的；天然感染的人和动物发展针对VP6表位的强体液应答。不论上述亚组，VP6是所有A组RV中高度保守的蛋白(＞90％的氨基酸同一性)，并且共享的共有抗原可以通过广泛反应性多克隆抗血清或单克隆抗体检测。因此，VP6是大部分设计用来检测A组RV的免疫诊断测试中的靶抗原。针对该蛋白的抗体在体外不具有中和活性。然而，在小鼠中，IgA单克隆抗体设法阻断病毒在细胞内复制。

目前，预防动物中RV-引起的腹泻基于被动免疫，而在人类中使用主动免疫。在动物中，将在肠胃外灭活的病毒疫苗应用于妊娠的雌兽，以通过由初乳和乳汁传递母体抗体而保护新生动物。该策略在防止严重腹泻症状和减少感染的家畜的发病率(morbility)和死亡率方面是高度有效的，但是这不能预防RV传染，因为这不显著减少由感染的动物分泌的病毒数量(Parreno，V.C.等，Vet Immunol Immunopathol(兽医免疫学和免疫病理学)100：7-24，2004)。只有在肠腔内持续存在高滴度的被动抗-RV抗体(天然产生的或人工添加到乳汁中的)完全防止腹泻，且显著减少病毒分泌(Fernandez，F.M.等，Vaccine(疫苗)16：507-16，1998；Saif，L.J.等，InfectImmun(传染免疫学)41：1118-31，1983，和Saif，L.J.等，Adv Exp Med Biol(实验医学和生物学进展)216B：1815-23，987)。

在儿童中，已经批准了两种通过遗传复性(reassociation)减毒的活病毒疫苗。已经证明两种产品针对严重RV-引起的腹泻的良好功效。然而，鉴于与先前人类中所用的疫苗相关的内填历史(Murphy，T.V.等，J InfectDis(传染病杂志)187：1309-13，2003)和最近在天然感染的儿童中发现RV病毒血症(Ray，P.等，J Infect Dis(传染病杂志)194：588-93，2006，和Blutt，S.E.等，Lancet362：1445-9，2003)，所述疫苗的无害性已经引起怀疑，特别是在早熟的(premature)、免疫抑制的和营养不良的儿童中。因此，对于RV-引起的腹泻的预防和治疗需要备选的补充策略。

被动免疫策略，如哺乳，施用由牛初乳或蛋类纯化的抗-RV抗体(人和牛抗-RV IgG和鸡蛋蛋黄IgY)显示出减少人和动物中的腹泻疾病。但是以低成本方式且具有可重现的特性生产大量抗体的可能性很低。因此，需要生产设计用于动物和人类中的被动抗-RV免疫的抗体，特别是可以以工业规模生产的抗体，所述抗体不引起免疫学反应，所述抗体充分小足以有效到达保守的内在蛋白的表位，且所述抗体能够识别和抑制来自不同基因型的毒株的复制(多反应性的)。