[发明专利]原位杂交以检测RNA和DNA标记

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2007年8月3日提交的名为“In-situ Hybridization to DetectRNA and DNA Markers(原位杂交以检测RNA和DNA标记)”的美国临时专利申请序列号60/953,812的优先权。

发明背景

胎儿细胞生物标记基本上有两类；胎儿细胞表面抗原及胞质蛋白的抗体，和优先在胎儿细胞而非母体细胞中表达的基因的基因表达标记。抗体标记可作直接或间接标记，采用荧光技术目测观察。然而，该方法的两个主要问题是血红素的自发荧光干扰抗体结合阳性染色的胎儿细胞的荧光信号；和通常与母体细胞上的抗原交叉反应的抗体的非特异性，这种非特异性产生极大的背景(信号)从而严重干扰胎儿细胞产生的信号。基因表达标记本身也有问题-所靶向的RNA通常不稳定，因此不能用于结合配体。

目测观察胎儿细胞的目前已知方法包括染色该细胞。用于此目的的染色剂有干扰，从而对于采用荧光原位杂交(FISH)作进一步分析造成了问题。

需要开发更多方法，例如非侵入性方法来检测胎儿细胞，特别是胎儿细胞相关的遗传学和/或基因标记。

发明概述

本发明部分依据发现可以在同一细胞中，特别是在允许原位检测RNA标记以及DNA标记的条件下检测RNA标记以及DNA标记。因此，本发明提供可用于检测RNA和DNA标记以及与之相关的遗传学疾病的探针、试剂盒和方法。

本发明的一个实施方式提供检测细胞中mRNA和染色体DNA的方法。该方法包括第一探针和第二探针与含有一种或多种靶细胞的生物学样品原位杂交。所述杂交在允许所述第一探针与靶细胞中其mRNA靶标特异性杂交，而所述第二探针与靶细胞中其染色体DNA靶标特异性杂交的条件下发生。所述第一探针与其mRNA靶标之间形成的双链体的Tm通常是至少约80℃。或者，所述第一探针的GC含量至少约40％。

本发明的另一实施方式提供检测胎儿的遗传学疾病的方法。该方法包括使第一探针和第二探针与含有胎儿的一种或多种胎儿细胞的生物学样品原位杂交。所述杂交在允许所述第一探针与胎儿细胞中其mRNA靶标特异性杂交，而所述第二探针与胎儿细胞中其染色体DNA靶标特异性杂交的条件下发生。所述第一探针与其mRNA靶标之间形成的双链体的Tm通常是至少约80℃，或者，所述第一探针的GC含量至少约40％。所述第一探针与其mRNA靶标和所述第二探针与其染色体DNA靶标的杂交表示胎儿的遗传学疾病。

本发明还有另一实施方式提供与胎儿细胞中mRNA靶标特异性杂交的探针。

本发明的另一实施方式提供装有本发明探针的试剂盒。

附图简述

图1显示了探针与细胞中mRNA的原位杂交以及对结合有mRNA的探针的检测。

图2显示了包含在特异性结合mRNA靶标的探针中的示范性修饰核苷酸。

图3是本发明示范性探针和它们某些特征的清单。小写字母表示正常的DNA碱基，而大写字母表示锁定核酸(LNA)碱基。

图4是原位mRNA杂交和随后检测胎儿细胞的示范性流程图。

图5A和5B是mRNA和FISH双阳性的胎儿细胞的荧光图。图5A表示用DIG标记的ε-mRNA-探针染色4个胎儿nRBC，其中所述DIG结合于抗-DIG-单克隆抗体与德克萨斯-红的偶联物。图5B表示用DAPI染色后4个相同nRBC的FISH信号。

图6A和6B是mRNA和FISH双阳性的胎儿细胞的荧光图。图6A表示3个ε-mRNA-探针染色的胎儿nRBC，而图6B显示用DAPI染色后3个相同细胞的FISH XY信号。

发明详述

本文所用的以下术语应具有以下意义：

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”具有相同的意义并且可在通篇互换使用。它们指由2个以上核苷酸亚单位从5’-端向3’-端共价连接在一起而构成的单链、定向核苷酸聚合物。

本说明书用于指代包含特定核碱基序列的多核苷酸或核酸的缩写是常规的单字母缩写。因此，当包含在多核苷酸中时，最常见的天然产生编码核碱基缩写成：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。除非另有指定，以一系列单-字母缩写表示单链核酸序列。

当两条序列中的一条与另一条以反平行的意义杂交从而形成“双链体”或“双链”时，称该两条序列“互补”，其中各序列的3’-端结合另一序列的5’-端，而一条序列的A、T(U)、G和C分别与另一序列的T(U)、A、C和G各自配对。